Preparação da superfície coclear no mouse adulto
Summary
Este artigo apresenta um método de preparação da superfície coclear modificado que requer decaltificação e uso de um adesivo de células e tecidos para aderir aos pedaços de epélia coclear a 10 mm de cobertura redonda para imunohistoquímica em córquia de camundongo adulto.
Abstract
O processamento auditivo na cóconlea depende da integridade das células ciliadas mecanosensorias. Ao longo da vida, a perda auditiva pode ser adquirida a partir de inúmeras etiologias, como exposição ao ruído excessivo, o uso de medicamentos ototóxicos, infecções bacterianas ou virais no ouvido, lesões na cabeça e o processo de envelhecimento. A perda de células ciliadas sensoriais é uma característica patológica comum das variedades de perda auditiva adquirida. Além disso, a sinapse da célula ciliada interna pode ser danificada por insultos leves. Portanto, as preparações superficiais da epitélia coclear, em combinação com técnicas de imunorotulagem e imagens confocais, são uma ferramenta muito útil para a investigação de patologias cocleares, incluindo perdas de sinapses de fita e células ciliadas sensoriais, alterações nos níveis de proteína nas células ciliadas e células de apoio, regeneração de células ciliadas e determinação da expressão gênica do relatório (ou seja, GFP) para verificação de transdução e identificação bem-sucedidas de tipos de células transinduzidas. A cócrolea, uma estrutura óssea em forma de espiral no ouvido interno, contém o órgão auditivo da extremidade sensorial, o órgão de Corti (OC). Células ciliadas sensoriais e células de apoio circundantes no OC estão contidas no duto coclear e descansam na membrana basilar, organizada de forma tonotópica com detecção de alta frequência ocorrendo na base e baixa frequência no ápice. Com a disponibilidade de informações moleculares e genéticas e a capacidade de manipular genes por nocaute e técnicas de knock-in, os ratos têm sido amplamente utilizados em pesquisas biológicas, inclusive na ciência auditiva. No entanto, a cócroes de camundongo adulto é minúscula, e o epitélio coclear é encapsulado em um labirinto ósseo, dificultando a microdissecção. Embora as técnicas da dissecação foram desenvolvidas e usadas em muitos laboratórios, este método modificado da microdissecção usando o adesivo da pilha e do tecido é mais fácil e mais conveniente. Ele pode ser usado em todos os tipos de cócroes de camundongoadulto após a decalcificação.
Introduction
A cóconlea é dedicada à detecção de som e responsável pela audição. O duto coclear é enrolado em forma espiral no labirinto ósseo e contém o órgão auditivo da extremidade sensorial, o órgão de Corti (OC). O OC repousa sobre a membrana basilar, tornando-se o epitélio coclear, com um comprimento de cerca de 5,7 mm quando desenrolado em adultos CBA / CaJ ratos1,2. Como o OC é organizado tonotópicamente com altas frequências detectadas na base e baixas frequências no ápice, o epitélio coclear é muitas vezes dividido em três partes para comparações analíticas: as voltas apical, média e basal correspondentes a baixa, detecção média e de alta frequência, respectivamente. Além de uma variedade de células de apoio, o OC é composto por uma fileira de células ciliadas internas (IHCs) localizadas medialmente e três fileiras de células ciliadas externas (OHCs) localizadas lateralmente no que diz respeito à espiral coclear.
O processamento auditivo correto depende da integridade das células ciliadas sensoriais na cóconlea. Danos ou perda de células ciliais sensoriais é uma característica patológica comum da perda auditiva adquirida, causada por inúmeras etiologias, como exposição ao ruído excessivo, o uso de medicamentos ototóxicos, infecções bacterianas ou virais no ouvido, lesões na cabeça e o envelhecimento processo3. Além disso, a integridade e função da célula ciliada interna / sinapses nervosas auditivas podem ser prejudicadas por insultos leves4. Com a disponibilidade de informações moleculares e genéticas e manipulação de genes por nocaute e técnicas de knock-in, os ratos têm sido amplamente utilizados na ciência auditiva. Embora a cócrolea de camundongo adulto seja minúscula e o epitélio coclear seja cercado por uma cápsula óssea, resultando em microdisseses tecnicamente difíceis, preparações superficiais do epitélio em combinação com imunorotulagem ou imunohistoquímica e imagens confocais têm sido amplamente utilizadas para investigação de patologias cocleares, incluindo perdas de sinapses de fita e células ciliadas, alterações nos níveis de proteínas nas células ciliadas sensoriais e células de apoio, e regeneração de células ciliadas. As preparações da superfície coclear também têm sido usadas para determinar o padrão de expressão de genes de repórter (ou seja, GFP) e confirmar a transdução bem-sucedida e identificar tipos de células transinduzidas. Essas técnicas têm sido usadas anteriormente para o estudo de mecanismos moleculares subjacentes à perda auditiva induzida pelo ruído usando camundongos ADULTOS CBA/J5,6,7,8,9.
Ao contrário da imunohistoquímica usando seções de parafina ou criosecção para obter pequenas porções transversais da córcia que contêm três células ciliadas externas (OHCs) e uma célula ciliada interna (IHC) em cada seção, as preparações da superfície coclear visualização de todo o comprimento do OC para a contagem de células ciliadas sensoriais e sinapses de fita e imunorotulagem de células ciliadas sensoriais correspondentes a freqüências funcionais específicas. A Tabela 1 mostra o mapeamento das frequências auditivas em função da distância ao longo do comprimento da espiral coclear em camundongo adulto CBA/J de acordo com estudos de Muller1 e Viberg e Canlon1,2. As preparações da superfície coclear têm sido amplamente utilizadas para investigação de patologias cocleares4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. O método de dissecção coclear de montagem inteira foi originalmente descrito em um livro editado por Hans Engstrom em 196616. Esta técnica foi posteriormente refinada e adaptada a uma variedade de espécies descritas na literatura por um número de cientistas na ciência auditiva10,11,12,13, 15,17 e pelos Laboratórios Eaton-Peabody em Massachusetts Eye and Ear18. Recentemente, outro método de dissecção coclear foi relatado por Montgomery et al.19. A microdissecção da cóconlea é um passo essencial e crítico para as preparações da superfície coclear. No entanto, dissecar cócroes de rato é um desafio técnico e requer uma prática considerável. Aqui, um método de preparação de superfície coclear modificado é apresentado para uso em cócroes de camundongos adultos. Este método requer decalcificação e uso de adesivo celular e tecido (ou seja, Cell-Tak) para aderir aos pedaços de epitélio coclear para 10 mm cobres redondos para imunorotulagem. O adesivo da pilha e do tecido foi amplamente utilizado para a imunohistoquímica20. Este método modificado de microdissese coclear é relativamente simples em comparação com os relatados anteriormente18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
A microdissecção coclearde de preparações de superfície de montagem inteira em combinação com imunorotulagem fornece uma ferramenta básica para a investigação de patologias do ouvido interno e mecanismos moleculares. Este método de dissecção coclear adulto modificado do rato usando o adesivo da pilha e do tecido simplifica este procedimento difícil.
Embora este método de preparação coclear modificado da superfície seja relativamente fácil e acessível, ainda exige a prática…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O projeto de pesquisa descrito foi apoiado pela concessão R01 DC0009222 do Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios da Comunicação, Institutos Nacionais de Saúde. Este trabalho foi realizado no Edifício WR no MUSC em espaço renovado apoiado pela concessão C06 RR014516. Os animais foram alojados em instalações animais MUSC CRI apoiadas pela concessão C06 RR015455 do Programa de Instalações de Pesquisa Extramural do Centro Nacional de Recursos de Pesquisa. Os autores agradecem ao Dr. Jochen Schacht por seus comentários valiosos e Andra Talaska pela revisão do manuscrito.
Materials
| 10-mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
References
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-10), (2004).
- Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after “temporary” noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).
- Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).
- Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).
- Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).
- Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).
- Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063 (2016).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. . Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).
- Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).
- . MassEyeAndEar.org Available from: https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019)
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- . Corning Cell Culture Surfaces Available from: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019)
- Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).
- Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the ‘hook’ region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).
- Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).
- Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262 (2014).
- Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).
