Cochlear-overflade forberedelse i voksen musen
Summary
Denne artikel præsenterer en modificeret cochlear-overflade forberedelsesmetode, der kræver afkalkning og brug af en celle og vævsklæber til at overholde delene af cochlear epitel til 10 mm runde Cover sedler til immun histokemi i voksne mus cochleae.
Abstract
Auditiv behandling i cochlea afhænger af integriteten af de mekanisosensoriske hårceller. Over et helt liv kan høretab erhverves fra talrige ætiologier såsom udsættelse for overdreven støj, brug af ototoksisk medicin, bakterielle eller virale øreinfektioner, hovedskader og aldringsprocessen. Tab af sensoriske hårceller er en fælles patologisk træk ved de sorter af erhvervet høretab. Desuden kan den indre hårcelle synapse blive beskadiget af milde fornærmelser. Derfor er overflade præparater af cochlear epithelia, i kombination med immunolabeling teknikker og konfokale billeder, et meget nyttigt værktøj til undersøgelse af cochlear-patologier, herunder tab af bånd synapser og sensoriske hårceller, ændringer i protein niveauer i hårceller og understøttende celler, hårcelle regenerering og bestemmelse af rapportens genekspression (dvs. GFP) til verifikation af vellykket transduktion og identifikation af transducerede celletyper. Cochlea, en Bony spiralformet struktur i det indre øre, besidder den auditive sensoriske ende orgel, orgel Corti (OC). Sensoriske hårceller og omgivende støtte celler i oC er indeholdt i cochlear kanalen og hviler på basilær membranen, organiseret i en tonotopisk mode med højfrekvens detektering, der forekommer i basen og lav frekvens i spidsen. Med tilgængeligheden af molekylære og genetiske oplysninger og evnen til at manipulere gener ved knockout og Knock-in teknikker, mus har været meget anvendt i biologisk forskning, herunder i hørelse videnskab. Men den voksne mus cochlea er minimal, og cochlear epitel er indkapslet i en knogle labyrint, hvilket gør microdissection vanskelig. Selv om dissektion teknikker er blevet udviklet og anvendes i mange laboratorier, denne modificerede microdissection metode ved hjælp af celle og væv klæbemiddel er lettere og mere bekvemt. Det kan bruges i alle typer af voksne mus cochleae efter afkalkning.
Introduction
Cochlea er dedikeret til påvisning af lyd og ansvarlig for hørelse. Cochlear kanalen er oprullet i en spiralform i knogle labyrinten og holder det auditive sensoriske ende organ, Corti-organet (OC). OC hviler på basilarmembranen, som udgør cochleepitel, med en længde på ca. 5,7 mm, når den ikke er coiled i voksne CBA/CAJ mus1,2. Fordi OC er tonotopisk organiseret med høje frekvenser detekteret i basen og lave frekvenser i spidsen, er cochleepitel ofte opdelt i tre dele til analytiske sammenligninger: apical, midterste og basal drejninger svarende til lav, henholdsvis mellem-og højfrekvens detektering. Ud over en række understøttende celler består OC af en række af indvendige hårceller (Ihc’er), der er placeret medielt og tre rækker af ydre hårceller (Ohc’er) placeret sideværts med hensyn til cochlear spiral.
Korrekt auditiv behandling afhænger af integriteten af de sensoriske hårceller i cochlea. Beskadigelse eller tab af sensoriske hårceller er et almindeligt patologisk træk ved erhvervet høretab, forårsaget af talrige ætiologier såsom udsættelse for overdreven støj, brug af ototoksisk medicin, bakterielle eller virale øreinfektioner, hovedskader og den aldrende proces3. Derudover kan integriteten og funktionen af den indre hårcelle/Auditive nerve synapser blive forringet af milde fornærmelser4. Med tilgængeligheden af molekylære og genetiske oplysninger og manipulation af gener ved knockout og Knock-in teknikker, har mus været meget udbredt i hørelse videnskab. Selvom den voksne mus cochlea er minuscule og cochlear epitel er omgivet af en knogle kapsel resulterer i teknisk vanskelige mikrodissektioner, overflade præparater af epitel i kombination med immunolabeling eller Immunhistokemi og konfokale billeder er blevet bredt anvendt til undersøgelse af cochlear-patologier, herunder tab af bånd synapser og hårceller, ændringer i niveauer af proteiner i sensoriske hårceller og understøttende celler og hårcelle regenerering. Cochlear-overflade præparater er også blevet brugt til at bestemme mønstret for ekspression af reporter gener (dvs. GFP) og bekræfte vellykket transduktion og identificere transducerede celletyper. Disse teknikker er tidligere blevet anvendt til studiet af molekylære mekanismer underliggende støj-induceret høretab ved hjælp af voksne CBA/J mus5,6,7,8,9.
I modsætning til immun histokemi ved brug af paraffin sektioner eller kryosektioner for at opnå små tværsnits dele af cochlea, der indeholder tre ydre hårceller (Ohc’er) og en inderhårcelle (IHC) på hver sektion, giver cochlear-overflade præparater visualisering af hele længden af OC for at tælle sensoriske hårceller og bånd synapser og immunolabeling af sensoriske hårceller svarende til specifikke funktionelle frekvenser. Tabel 1 viser kortlægningen af høre frekvenser som en funktion af afstanden langs cochlear spiralens længde i voksne CBA/J-mus i henhold til undersøgelser fra Muller1 og Viberg og canlon1,2. Cochlear-overflade præparater er blevet anvendt i vid udstrækning til undersøgelse af cochlear-patologier4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. Den samlede cochlear dissektion-metode blev oprindelig beskrevet i en bog redigeret af hans engstrom i 196616. Denne teknik blev efterfølgende raffineret og tilpasset til en række forskellige arter som beskrevet i litteraturen af en række videnskabsmænd i høre videnskab10,11,12,13, 15,17 og af Eaton-Peabody Laboratories i Massachusetts Eye og ear18. For nylig blev en anden cochlear dissektion-metode rapporteret af Montgomery et al.19. Microdissection af cochlea er et vigtigt og kritisk skridt for cochlear-overflade præparater. Men det er en teknisk udfordring at dissekende mus cochleae, og det kræver stor praksis. Her præsenteres en modificeret cochlear-overflade forberedelsesmetode til brug i en voksen mus cochleae. Denne metode kræver afkalkning og brug af celle-og vævsklæber (dvs. celle-tak) for at overholde delene af cochlear epitel til 10 mm runde dæksedler til immunolabeling. Celle-og vævsklæber er blevet anvendt i vid udstrækning til immun histokemi20. Denne modificerede cochlear microdissection metode er relativt enkel i forhold til de tidligere rapporterede18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cochlear microdissection af hele Mount overflade præparater i kombination med immunolabeling giver et grundlæggende værktøj til undersøgelse af indre øre patologier og molekylære mekanismer. Denne modificerede voksne mus cochlear dissektion metode ved hjælp af cellen og væv klæbemiddel forenkler denne vanskelige procedure.
Selv om denne modificerede cochlear-overflade forberedelsesmetode er relativt let og tilgængelig, kræver det stadig øvelse for at opnå færdig færdighed. For …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Det beskrevne forskningsprojekt blev støttet af Grant R01 DC009222 fra det nationale Institut for døvhed og andre kommunikationsforstyrrelser, National Institutes of Health. Dette arbejde blev udført i WR Building i MUSC i renoveret rum understøttet af Grant C06 RR014516. Dyrene blev anbragt i MUSC CRI-dyre anlæg, der blev støttet af Grant C06 RR015455 fra det nationale center for forsknings ressourcers Extramural Research-program. Forfatterne takker Dr. Jochen Schacht for hans værdifulde kommentarer og Andra Talaska for korrekturlæsning af manuskriptet.
Materials
| 10-mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
References
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-10), (2004).
- Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after “temporary” noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).
- Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).
- Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).
- Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).
- Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).
- Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063 (2016).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. . Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).
- Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).
- . MassEyeAndEar.org Available from: https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019)
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- . Corning Cell Culture Surfaces Available from: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019)
- Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).
- Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the ‘hook’ region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).
- Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).
- Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262 (2014).
- Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).
