Summary
Denne artikkelen presenterer en modifisert cochlear overflate Forberedelses metode som krever Avkalking og bruk av en celle og vev lim for å overholde deler av cochlear prolifererende til 10 mm runde deksel slips for immunhistokjemi i voksen mus cochleae.
Abstract
Hørselsbehandling i sneglehuset avhenger av integriteten til de mechanosensory hårcellene. Over en levetid, hørselstap kan skaffes fra mange årsaker som eksponering for overdreven støy, bruk av ototoxic medisiner, bakteriell eller viral øret infeksjoner, hodeskader, og aldringsprosessen. Tap av sensoriske hårceller er en vanlig patologisk funksjon i varianter av ervervet hørselstap. I tillegg kan den indre hår celle synapse bli skadet av milde fornærmelser. Derfor er overflate preparater av cochlear prolifererende, i kombinasjon med immunolabeling teknikker og konfokalmikroskopi bilder, et svært nyttig verktøy for etterforskning av cochlear patologi, inkludert tap av bånd synapser og sanse hårceller, endringer i proteinnivåer i hårceller og støtte celler, hår celle regenerering, og fastsettelse av rapport genuttrykk (dvs. GFP) for verifisering av vellykket Transduction og identifisering av transduced celletyper. Cochlea, en tynn spiral-formet struktur i det indre øret, holder hørsels sensorisk ende organ, orgelet i Corti (OC). Sensoriske hårceller og omkringliggende støtte celler i OC finnes i cochlea-kanalen og hviler på basilar membranen, organisert i en tonotopic mote med høyfrekvent deteksjon som forekommer i basen og lav frekvens i Apex. Med tilgjengeligheten av molekylær og genetisk informasjon og evnen til å manipulere gener ved knockout og knock-in teknikker, har mus vært mye brukt i biologisk forskning, blant annet i hørsels vitenskap. Men den voksne musen cochlea er minimale, og cochlear epitel er innkapslet i en tynn labyrint, noe som gjør microdissection vanskelig. Selv om disseksjon teknikker har blitt utviklet og brukt i mange laboratorier, er denne modifiserte microdissection metoden ved hjelp av celle og vev lim enklere og mer praktisk. Den kan brukes i alle typer voksen mus cochleae følgende Avkalking.
Introduction
Cochlea er dedikert til påvisning av lyd og ansvarlig for hørsel. Cochlea-kanalen er spiral i en spiralform i bein labyrinten og holder hørsels sensorisk ende organ, orgelet i Corti (OC). OC hviler på basilar membranen, noe som gjør opp cochlear epitel, med en lengde på ca 5,7 mm når rulles i voksen CBA/CaJ mus1,2. Fordi OC er tonotopically organisert med høye frekvenser oppdages i basen og lave frekvenser i Apex, er cochlear epitel ofte delt inn i tre deler for analytiske sammenligninger: Den apikale, midtre og basale svinger tilsvarende lav, Middels, og høy frekvens deteksjon, henholdsvis. I tillegg til en rekke støtte celler, er OC sammensatt av en rad med indre hårceller (IHCs) som ligger anteriort og tre rader med ytre hårceller (OHCs) som ligger sidelengs med hensyn til cochlear spiral.
Riktig hørselsbehandling avhenger av integriteten til de sensoriske hårcellene i sneglehuset. Skade på eller tap av sensoriske hårceller er en vanlig patologisk funksjon av ervervet hørselstap, forårsaket av en rekke årsaker som for eksempel eksponering for overdreven støy, bruk av ototoxic medisiner, bakteriell eller viral øret infeksjoner, hodeskader, og den aldrende prosess3. I tillegg kan integriteten og funksjonen til det indre hår celle/hørselsnerven synapser svekkes av milde fornærmelser4. Med tilgjengeligheten av molekylær og genetisk informasjon og manipulering av gener ved knockout og knock-in teknikker, har mus vært mye brukt i hørsel vitenskap. Selv om den voksne musen cochlea er ørsmå og cochlear epitel er omgitt av en bein kapsel som resulterer i teknisk vanskelig microdissections, overflate preparater av epitel i kombinasjon med immunolabeling eller immunhistokjemi og konfokalmikroskopi bilder har blitt brukt i stor grad for undersøkelse av cochlear patologi, inkludert tap av bånd synapser og hårceller, endringer i nivåer av proteiner i sensoriske hårceller og støtte celler, og hår celle regenerering. Cochlear overflate forberedelser har også blitt brukt til å bestemme mønsteret for uttrykk for reporter gener (dvs. GFP) og bekrefte vellykket Transduction og identifisere transduced celletyper. Disse teknikkene har tidligere blitt brukt til studiet av molekylære mekanismer underliggende støy-indusert hørselstap ved hjelp av voksen CBA/J mus5,6,7,8,9.
I motsetning til immunhistokjemi som bruker para fin seksjoner eller cryosections for å oppnå små tverrsnitt deler av cochlea som inneholder tre ytre hårceller (OHCs) og en indre hår celle (IHC) på hver del, tillater visualisering av hele lengden av OC for telling av sensoriske hårceller og bånd synapser og immunolabeling av sensoriske hårceller som tilsvarer spesifikke funksjonelle frekvenser. Tabell 1 viser kartlegging av hørsel frekvenser som en funksjon av avstand langs lengden av cochlear spiral i voksen CBA/J Mouse Ifølge studier fra Muller1 og Viberg og Canlon1,2. Cochlear Surface-preparater har blitt mye brukt til undersøkelse av cochlear patologi4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. Den hel-Mount cochlear disseksjon metoden ble opprinnelig beskrevet i en bok redigert av hans Engstrom i 196616. Denne teknikken ble senere raffinert og tilpasset en rekke arter som beskrevet i litteraturen av en rekke forskere i høring Science10,12,13, 15,17 og ved Eaton-Peabody Laboratories ved Massachusetts Eye og Ear18. Nylig ble en annen cochlear disseksjon metode rapportert av Montgomery et al.19. Microdissection av cochlea er et viktig og kritisk trinn for forberedelser til overflate forberedelse av cochlea. Imidlertid, dissekere musen cochleae er en teknisk angripe og behøver betydelig praksis. Her presenteres en modifisert cochlear overflate forberedelse metoden for bruk i voksen mus cochleae. Denne metoden krever Avkalking og bruk av celle og vev lim (dvs. Cell-tak) for å overholde bitene av cochlear epitel til 10 mm runde coverslips for immunolabeling. Celle og vev limet har vært mye brukt for immunhistokjemi20. Denne modifiserte cochlear microdissection-metoden er relativt enkel sammenlignet med de tidligere rapporterte18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cochlear-microdissection av overflate forberedelser i kombinasjon med immunolabeling gir et grunnleggende verktøy for etterforskning av indre øre sykdommer og molekylære mekanismer. Denne modifiserte voksen musen cochlear disseksjon metoden ved hjelp av celle og vev limet forenkler denne vanskelige prosedyren.
Selv om denne endrede cochlear forbehandling metoden er relativt enkel og tilgjengelig, krever det fortsatt praksis for å oppnå ferdigheter. For å gjøre de riktige kuttene, trenge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningsprosjektet beskrevet ble støttet av stipend R01 DC009222 fra National Institute on døvhet og andre kommunikasjons forstyrrelser, National Institutes of Health. Dette arbeidet ble gjennomført i WR Building på MUSC i renovert plass støttes av stipend C06 RR014516. Dyr ble plassert i MUSC CRI dyr anlegg støttes av stipend C06 RR015455 fra ekstra Research fasiliteter program av National Center for Research Resources. Forfatterne takker Dr. Jochen Schacht for hans verdifulle kommentarer og Andra Talaska for korrekturlesing av manuskriptet.
Materials
| 10-mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
References
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-10), (2004).
- Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after “temporary” noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).
- Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).
- Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).
- Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).
- Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).
- Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063 (2016).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. . Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).
- Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).
- . MassEyeAndEar.org Available from: https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019)
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- . Corning Cell Culture Surfaces Available from: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019)
- Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).
- Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the ‘hook’ region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).
- Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).
- Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262 (2014).
- Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).
