在这里,我们提出了一个强大的协议,以量化40个化合物参与中央碳和能量代谢在无细胞蛋白质合成反应。无细胞合成混合物用抗氧化剂衍生,使用反相液相色谱进行有效分离,然后使用异位标记的内部标准通过质谱法进行量化。
无细胞蛋白合成(CFPS)是蛋白质体外生产的系统和合成生物学的新兴技术。但是,如果 CFPS 要超越实验室,成为一种广泛而标准的及时制造技术,我们必须了解这些系统的性能限制。针对这个问题,我们开发了一个强大的协议,以量化参与糖解的40种化合物,磷酸五氯苯基,三聚碳酸循环,能量代谢和CFPS反应中的副因子再生。该方法使用带有13种C-单一体标记的内部标准,而样品中的化合物则用12种C-aniline进行衍生。通过反相液相色谱-质谱法(LC/MS)对内部标准和样品进行混合和分析。化合物的共洗脱消除了电子抑制,使代谢物浓度在平均相关系数为0.988的2-3个量级以上进行精确定量。四十种化合物中有五种未加用碱标记,然而,它们仍在CFPS样本中检测到,并采用标准曲线法进行量化。色谱运行大约需要 10 分钟才能完成。综合起来,我们开发了一种快速、可靠的方法,在一次LC/MS运行中分离和准确量化CFPS中涉及的40种化合物。该方法是描述无细胞代谢的一种全面而准确的方法,因此,我们最终能够了解并提高无细胞系统的产量、生产率和能源效率。
无细胞蛋白质合成(CFPS)是制造蛋白质和化学品的有前途的平台,这种应用传统上是为活细胞保留的。无细胞系统来自粗细胞提取物,并消除与细胞生长相关的并发症1。此外,CFPS 允许直接访问代谢物和生物合成机械,无需细胞壁干扰。然而,对无细胞过程的性能限制缺乏基本的了解。高通量代谢物定量方法对代谢表征有价值,对代谢计算模型2、3、4的构建至关重要。用于确定代谢物浓度的常见方法包括核磁共振 (NMR)、傅立叶变换红外光谱 (FT-IR)、基于酶的测定法和质谱 (MS)5、6、7 ,8.然而,这些方法往往受限于它们无法同时有效地测量多种化合物,并且通常需要比典型的无细胞反应更大的样本大小。例如,基于酶的检测通常只能用于在运行中量化单个化合物,并且在样本量较小时(如无细胞蛋白合成反应(通常在 10-15 μL 尺度上运行)时受到限制。同时,NMR需要高丰度代谢物来检测和定量5。 针对这些缺点,色谱方法与质谱(LC/MS)结合提供了几个优点,包括高灵敏度和同时测量多个物种的能力9;然而,分析复杂性随着被测量物种的数量和多样性而大大增加。因此,开发能够充分实现LC/MS系统高通量潜力的方法非常重要。样品中的化合物通过液相色谱分离,并通过质谱法进行鉴定。化合物的信号取决于其浓度和电电化效率,其中电电化在化合物之间可能有所不同,也可能取决于样品矩阵。
在使用LC/MS对分析物进行量化时,在样品和标准之间实现相同的电电化效率是一项挑战。此外,由于质子亲和力和极性10的信号分裂和异质性,代谢物多样性的定量变得更加具有挑战性。最后,样品的共解基质也会影响化合物的电电化效率。为了解决这些问题,代谢物可以化学衍生,提高LC/MS系统的分离分辨率和灵敏度,同时在某些情况下减少信号分裂10,11。化学衍生的工作原理是标记代谢物的特定功能组,以调整其物理特性,如电荷或疏水性,以提高电化效率11。各种标记剂可用于针对不同的功能组(例如,胺、羟基、磷酸盐、碳化物酸等)。Aniline,一种这样的衍生剂,一次瞄准多个功能组,并在亲水分子中加入疏水成分,从而提高其分离分辨率和信号12。为了解决共发基质电抑制效应,杨和同事开发了一种基于组特定内部标准技术 (GSIST) 标签的技术,其中标准标有13 C阴宁同位素,并与样品混合12,13.代谢物和相应的内部标准自共溶以来具有相同的电化效率,其强度比可用于定量实验样品中的浓度。
在这项研究中,我们开发了一个协议来检测和量化参与糖解的40种化合物,磷酸五氯苯星通路,三聚碳酸循环,能量代谢和CFPS反应中的副因子再生。该方法基于GSIST方法,我们使用12种C-单一素和13种C-aniline来标记、检测和量化代谢物,使用逆相LC/MS。所有化合物的线性范围跨越2-3个数量级,平均相关系数为0.988。因此,该方法是一种可靠而准确的方法,用于询问无细胞代谢,以及可能全细胞提取物。
无细胞系统没有细胞壁,因此可以直接获得代谢物和生物合成机械,而无需复杂的样品制备。然而,在开发彻底和可靠的协议以定量询问无细胞反应系统方面,我们几乎没有做多少工作。在这项研究中,我们开发了一种快速、可靠的方法,用于量化无细胞反应混合物中的代谢物,并可能在全细胞提取物中量化代谢物。复杂混合物中代谢物的单独定量,如无细胞反应或全细胞提取物中的代谢物,由?…
The authors have nothing to disclose.
所述工作通过国家癌症研究所(https://www.cancer.gov/)颁发的第1U54CA210184-01奖,得到了癌症代谢物理中心的支持。内容完全由作者负责,不一定代表国家癌症研究所或国家卫生研究院的官方观点。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有作用。
12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
myTXTL – Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
Waters Empower 3 | Waters | Software | |
Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |