Absolute Quantifizierung des zellfreien Proteinsynthesestoffwechsels durch Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry
Summary
Hier präsentieren wir ein robustes Protokoll zur Quantifizierung von 40 Verbindungen, die am zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel in zellfreien Proteinsynthesereaktionen beteiligt sind. Das zellfreie Synthesegemisch wird mit Anilin zur effektiven Trennung mittels umgekehrter Flüssigchromatographie abgeführt und dann durch Massenspektrometrie unter isotopisch gekennzeichneten internen Standards quantifiziert.
Abstract
Die zellfreie Proteinsynthese (CFPS) ist eine neue Technologie in Systemen und synthetischer Biologie zur In-vitro-Produktion von Proteinen. Wenn CFPS jedoch über das Labor hinausgehen und zu einem weit verbreiteten und standardgerechten Fertigungstechnologie werden, müssen wir die Leistungsgrenzen dieser Systeme verstehen. Zu dieser Frage haben wir ein robustes Protokoll entwickelt, um 40 Verbindungen zu quantifizieren, die an der Glykolyse, dem Pentosephosphatweg, dem Tricarbonsäurezyklus, dem Energiestoffwechsel und der Kofaktorregeneration in CFPS-Reaktionen beteiligt sind. Die Methode verwendet interne Standards mit 13C-Aniline markiert, während Verbindungen in der Probe mit 12C-Aniline derivatisiert werden. Die internen Standards und Proben wurden durch die umgekehrte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC/MS) gemischt und analysiert. Die Ko-Elution von Verbindungen eliminierte die Ionenunterdrückung, was eine genaue Quantifizierung der Metabolitenkonzentrationen über 2-3 Größenordnungen ermöglichte, wobei der durchschnittliche Korrelationskoeffizient 0,988 betrug. Fünf der vierzig Verbindungen wurden mit Aniline nicht markiert, wurden jedoch noch in der CFPS-Probe nachgewiesen und mit einer Standardkurvenmethode quantifiziert. Der chromatographische Lauf dauert ca. 10 min. Zusammen genommen haben wir eine schnelle, robuste Methode entwickelt, um 40 Verbindungen, die an CFPS beteiligt sind, in einem einzigen LC/MS-Lauf zu trennen und genau zu quantifizieren. Die Methode ist ein umfassender und genauer Ansatz zur Charakterisierung des zellfreien Stoffwechsels, so dass wir letztendlich die Ausbeute, Produktivität und Energieeffizienz zellfreier Systeme verstehen und verbessern können.
Introduction
Die zellfreie Proteinsynthese (CFPS) ist eine vielversprechende Plattform für die Herstellung von Proteinen und Chemikalien, eine Anwendung, die traditionell lebenden Zellen vorbehalten ist. Zellfreie Systeme werden aus rohen Zellextrakten abgeleitet und eliminieren die Komplikationen im Zusammenhang mit dem Zellwachstum1. Darüber hinaus ermöglicht CFPS den direkten Zugang zu Metaboliten und biosynthetischen Maschinen ohne Die Interferenz einer Zellwand. Es fehlt jedoch an einem grundlegenden Verständnis der Leistungsgrenzen zellfreier Prozesse. Hochdurchsatzmethoden zur Metabolitenquantifizierung sind wertvoll für die Charakterisierung des Stoffwechsels und entscheidend für den Aufbau metabolischer Rechenmodelle2,3,4. Häufige Methoden zur Bestimmung der Metabolitenkonzentrationen sind Kernspinresonanz (NMR), Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie (FT-IR), enzymbasierte Assays und Massenspektrometrie (MS)5,6,7 ,8. Diese Methoden sind jedoch oft durch ihre Unfähigkeit, mehrere Verbindungen gleichzeitig effizient zu messen, begrenzt und erfordern oft eine Probengröße, die größer ist als typische zellfreie Reaktionen. Beispielsweise können enzymbasierte Assays oft nur zur Quantifizierung einer einzelnen Verbindung in einem Lauf verwendet werden und sind begrenzt, wenn die Stichprobengröße klein ist, z. B. bei zellfreien Proteinsynthesereaktionen (in der Regel auf einer Skala von 10-15 L). In der Zwischenzeit erfordert NMR eine hohe Fülle von Metaboliten für die Detektion und Quantifizierung5. Angesichts dieser Unzulänglichkeiten bieten Chromatographiemethoden in Verbindung mit der Massenspektrometrie (LC/MS) mehrere Vorteile, darunter eine hohe Empfindlichkeit und die Fähigkeit, mehrere Arten gleichzeitig zu messen9; Die analytische Komplexität nimmt jedoch erheblich zu, da die Anzahl und Vielfalt der Arten gemessen wird. Daher ist es wichtig, Methoden zu entwickeln, die das Hohe Durchsatzpotenzial von LC/MS-Systemen voll ausschöpfen. Verbindungen in einer Probe werden durch flüssige Chromatographie getrennt und durch Massenspektrometrie identifiziert. Das Signal der Verbindung hängt von seiner Konzentration und Ionisationseffizienz ab, wobei die Ionisation zwischen Verbindungen variieren kann und auch von der Probenmatrix abhängen kann.
Die gleiche Ionisationseffizienz zwischen der Probe und den Standards zu erreichen, ist eine Herausforderung, wenn LC/MS zur Quantifizierung von Analyten verwendet wird. Darüber hinaus wird die Quantifizierung mit der Metabolitenvielfalt aufgrund der Signalspaltung und Heterogenität in Protonenaffinität und Polarität10schwieriger. Schließlich kann die Co-Eluing-Matrix der Probe auch die Ionisierungseffizienz der Verbindungen beeinflussen. Um diese Probleme zu lösen, können Metaboliten chemisch ableitungsiert werden, wodurch die Trennungsauflösung und Empfindlichkeit durch LC/MS-Systeme erhöht wird, während gleichzeitig die Signalspaltung in einigen Fällen10,11verringert wird. Chemische Derivatisierung funktioniert durch Tagging bestimmte funktionelle Gruppen von Metaboliten, um ihre physikalischen Eigenschaften wie Ladung oder Hydrophobizität anzupassen, um die Ionisationseffizienz zu erhöhen11. Verschiedene Tagging-Mittel können verwendet werden, um verschiedene funktionelle Gruppen (z.B. Aumine, Hydroxyle, Phosphate, Carbonsäuren usw.) anzusprechen. Aniline, ein solches Derivatisierungsmittel, zielt auf mehrere funktionelle Gruppen gleichzeitig ab und fügt eine hydrophobe Komponente in hydrophile Moleküle ein, wodurch ihre Trennungsauflösung und das Signal12erhöht werden. Um den Co-Eluing-Matrix-Ionenunterdrückungseffekt zu beheben, entwickelten Yang und seine Mitarbeiter eine Technik, die auf der Group Specific Internal Standard Technology (GSIST)-Kennzeichnung basiert, bei der Standards mit 13C-Aniline-Isotopen markiert und mit der Probe gemischt werden. 12,13. Der Metabolit und der entsprechende interne Standard haben die gleiche Ionisationseffizienz, da sie ko-elute, und ihr Intensitätsverhältnis kann verwendet werden, um die Konzentration in der experimentellen Probe zu quantifizieren.
In dieser Studie haben wir ein Protokoll entwickelt, um 40 Verbindungen zu detektieren und zu quantifizieren, die an der Glykolyse, dem Pentosephosphatweg, dem Tricarbonsäurezyklus, dem Energiestoffwechsel und der Kofaktorregeneration in CFPS-Reaktionen beteiligt sind. Die Methode basiert auf dem GSIST-Ansatz, bei dem wir 12C-Aniline und 13C-Aniline verwendet haben, um Metaboliten mit umgekehrter Phase LC/MS zu markieren, zu erkennen und zu quantifizieren. Der lineare Bereich aller Verbindungen umfasste 2-3 Größenordnungen mit einem durchschnittlichen Korrelationskoeffizienten von 0,988. Somit ist die Methode ein robuster und genauer Ansatz, um den zellfreien Stoffwechsel und möglicherweise Vollzellextrakte abzuhören.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zellfreie Systeme haben keine Zellwand, so dass es direkten Zugang zu Metaboliten und den biosynthetischen Maschinen ohne komplexe Probenvorbereitung gibt. Es wurde jedoch nur sehr wenig an der Entwicklung gründlicher und robuster Protokolle zur quantitativen Abhörung zellfreier Reaktionssysteme gearbeitet. In dieser Studie haben wir eine schnelle, robuste Methode zur Quantifizierung von Metaboliten in zellfreien Reaktionsgemischen und potenziell in Ganzzellextrakten entwickelt. Die individuelle Quantifizierung von Met…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die beschriebene Arbeit wurde vom Center on the Physics of Cancer Metabolism durch den Award Nummer 1U54CA210184-01 des National Cancer Institute ( https://www.cancer.gov/ ) unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Cancer Institute oder der National Institutes of Health dar. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| 12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
| 13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
| 3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
| Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
| Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
| Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
| Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
| Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
| Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
| Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
| Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
| Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
| Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
| D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
| Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
| Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
| Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
| Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
| Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
| Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
| Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
| Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
| Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
| Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
| Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
| Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
| Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
| Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
| Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
| myTXTL – Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
| Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
| Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
| Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
| Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
| Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
| Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
| ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
| Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
| Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
| Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
| VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
| Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
| Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | Software | |
| Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |
References
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
- Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
- Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
- Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012 (2017).
- Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
- Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
- Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
- Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
- Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
- Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
- Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
- Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
- Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J., Metz, T. O. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). , 159-171 (2011).
- Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).
