Absolutt kvantifisering av Cell-fri protein syntese metabolisme av reversert-fase flytende kromatografi-Mass massespektrometri
Summary
Her presenterer vi en robust protokoll for å kvantifisere 40 forbindelser involvert i Sentral karbon og energi metabolisme i celle-fri protein syntese reaksjoner. Den celle frie syntese blandingen er derivatized med anilin for effektiv separasjon ved hjelp av reversert-fase flytende kromatografi og deretter kvantifisert av masse massespektrometri bruker isotopically merket interne standarder.
Abstract
Celle-fri proteinsyntese (CFPS) er en ny teknologi i systemer og syntetisk biologi for in vitro produksjon av proteiner. Men hvis CFPS kommer til å gå utover laboratoriet og bli en utbredt og standard akkurat i tide produksjon teknologi, må vi forstå ytelsen grensene for disse systemene. Mot dette spørsmålet, utviklet vi en robust protokoll for å kvantifisere 40 forbindelser involvert i Glykolysen, den pentose fosfat veien, tricarboxylic syre syklus, energi metabolisme og kofaktor regenerering i CFPS reaksjoner. Metoden bruker interne standarder merket med 13c-anilin, mens forbindelser i utvalget er derivatized med 12c-anilin. Den interne standarder og prøven ble blandet og analysert av reversert-fase flytende kromatografi-Mass massespektrometri (LC/MS). Eluering av forbindelser eliminert ion undertrykkelse, slik at nøyaktig kvantifisering av metabolitten konsentrasjoner over 2-3 størrelsesordener der den gjennomsnittlige korrelasjonskoeffisienten var 0,988. Fem av de 40 forbindelsene ble umerkede med anilin, men de ble likevel oppdaget i CFPS prøven og kvantifisert med en standard kurve metode. Det kromatografiske løpe tar ca 10 min å fullføre. Til sammen har vi utviklet en rask, robust metode for å skille og nøyaktig kvantifisere 40 forbindelser involvert i CFPS i en enkelt LC/MS Run. Metoden er en omfattende og nøyaktig tilnærming til å karakterisere celle-fri metabolisme, slik at til slutt, kan vi forstå og forbedre avkastningen, produktivitet og energieffektivisering av celle-frie systemer.
Introduction
Cell-fri proteinsyntese (CFPS) er en lovende plattform for produksjon av proteiner og kjemikalier, et program som tradisjonelt har vært forbeholdt levende celler. Cell-frie systemer er avledet fra rå celle ekstrakter og eliminere komplikasjoner forbundet med cellevekst1. I tillegg gir CFPS for direkte tilgang til metabolitter og biosyntetiske maskiner uten innblanding av en cellevegg. Imidlertid har en fundamental forståelse av ytelsen grensene for celle-fri prosesser manglet. Høy gjennomstrømming metoder for metabolitten kvantifisering er verdifulle for karakterisering av metabolisme og er avgjørende for bygging av metabolske beregningsorientert modeller2,3,4. Vanlige metoder som brukes til å bestemme metabolitten konsentrasjoner inkluderer kjernefysisk magnetisk resonans (NMR), Fourier Transform-infrarød spektroskopi (FT-IR), enzym-baserte analyser, og Mass massespektrometri (MS)5,6,7 ,8. Men disse metodene er ofte begrenset av deres manglende evne til å effektivt måle flere forbindelser samtidig og ofte krever en utvalgsstørrelse større enn typiske celle-frie reaksjoner. Enzymbasert analyser kan for eksempel ofte bare brukes til å kvantifisere en enkelt forbindelse i en løpetur, og er begrenset når utvalgsstørrelsen er liten, for eksempel i celle frie protein syntese reaksjoner (vanligvis kjøres på en 10-15-skala på μL). I mellomtiden krever NMR en høy overflod av metabolitter for deteksjon og kvantifisering5. Mot disse svakhetene, kromatografi metoder i tandem med masse massespektrometri (LC/MS) gir flere fordeler, inkludert høy følsomhet og evnen til å måle flere arter samtidig9; imidlertid øker den analytiske kompleksiteten betraktelig med antallet og mangfoldet av arter som måles. Det er derfor viktig å utvikle metoder som fullt ut realiserer potensialet i LC/MS-systemer med høy gjennomstrømming. Sammensetninger i en prøve er adskilt av flytende kromatografi og identifisert gjennom masse massespektrometri. Signalet av det sammensatte avhenger av konsentrasjonen og ionisering effektivitet, hvor ionisering kan variere mellom forbindelser og kan også avhenge av utvalget matrise.
Å oppnå samme ionisering effektivitet mellom prøven og standardene er en utfordring ved bruk av LC/MS for å kvantifisere analytter. Videre blir kvantifisering mer utfordrende med metabolitten mangfold på grunn av signal splitting og heterogenitet i Proton affinitet og polaritet10. Til slutt, den co-tent matrise av prøven kan også påvirke ionisering effektiviteten av forbindelsene. For å løse disse problemene, kan metabolitter være kjemisk derivatized, øke separasjon oppløsning og følsomhet av LC/MS systemer, samtidig redusere signal splitting i noen tilfeller10,11. Kjemisk derivatization fungerer ved å tagge spesifikke funksjonsgrupper av metabolitter for å justere sine fysiske egenskaper som ladning eller hydrofobisiteten for å øke ionisering effektivitet11. Ulike merking agenter kan brukes til å målrette ulike funksjonelle grupper (f. eks aminer, hydroksyler, fosfater, kar bok syls syrer, etc.). Anilin, en slik derivatization agent, mål flere funksjonelle grupper samtidig, og legger en hydrofobe komponent i hydrofile molekyler, og dermed øke deres separasjon oppløsning og signal12. For å håndtere co-tent Matrix ion undertrykkelse effekt, Yang og kolleger utviklet en teknikk basert på Group Specific intern standard Technology (GSIST) merking der standarder er merket med 13C anilin isotoper og blandes med prøven 12,13. Metabolitten og tilsvarende interne standarden har samme ionisering effektivitet siden de co-eluere, og deres intensitet ratio kan brukes til å kvantifisere konsentrasjonen i den eksperimentelle prøven.
I denne studien, utviklet vi en protokoll for å oppdage og kvantifisere 40 forbindelser involvert i Glykolysen, den pentose fosfat veien, tricarboxylic syre syklus, energi metabolisme og kofaktor regenerering i CFPS reaksjoner. Metoden er basert på GSIST tilnærming, der vi brukte 12c-anilin og 13c-anilin å merke, oppdage og kvantifisere metabolitter bruker reversert-fase LC/MS. Den lineære rekkevidden av alle forbindelser spredte 2-3 størrelsesordener med en gjennomsnittlig korrelasjonskoeffisient på 0,988. Således er metoden en robust og nøyaktig tilnærming til å forhøre celle-fri metabolisme, og muligens hel celle ekstrakter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Celle frie systemer har ingen cellevegg, og dermed er det direkte tilgang til metabolitter og biosyntetiske maskiner uten behov for komplekse prøve forberedelser. Men svært lite arbeid har blitt gjort for å utvikle grundige og robuste protokoller for å kvantitativt avhøre celle-fri reaksjons systemer. I denne studien utviklet vi en rask og robust metode for å kvantifisere metabolitter i celle frie reaksjonsblandinger og potensielt i hel celle ekstrakter. Individuell kvantifisering av metabolitter i komplekse blandi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet beskrevet ble støttet av Center på Physics of Cancer metabolisme gjennom Award Number 1U54CA210184-01 fra National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Cancer Institute eller National Institutes of Health. Oppdragsgivers hadde ingen rolle i studien design, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| 12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
| 13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
| 3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
| Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
| Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
| Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
| Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
| Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
| Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
| Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
| Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
| Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
| Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
| D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
| Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
| Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
| Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
| Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
| Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
| Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
| Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
| Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
| Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
| Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
| Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
| Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
| Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
| Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
| Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
| myTXTL – Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
| Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
| Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
| Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
| Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
| Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
| Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
| ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
| Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
| Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
| Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
| VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
| Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
| Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | Software | |
| Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |
References
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
- Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
- Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
- Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012 (2017).
- Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
- Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
- Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
- Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
- Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
- Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
- Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
- Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
- Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J., Metz, T. O. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). , 159-171 (2011).
- Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).
