Summary
Denne protokol blev genereret som et middel til at producere hjernen organoids i en forenklet, lav pris måde uden udefrakommende vækstfaktorer eller kælder membran matrix og samtidig opretholde mangfoldigheden af hjernecelletyper og mange funktioner i cellulære organisation.
Abstract
Menneskelige hjerne organoider differentieret fra embryonale stamceller giver en enestående mulighed for at studere komplicerede interaktioner af flere celletyper i et tredimensionelt system. Her præsenterer vi en relativt ligetil og billig metode, der giver hjernen organoids. I denne protokol nedbrydes humane pluripotente stamceller i små klynger i stedet for enkelte celler og dyrkes i grundlæggende medier uden en heterolog kældermembranmatrix eller udefrakommende vækstfaktorer, hvilket gør det muligt for de iboende udviklingssignaler at forme organoid vækst. Dette enkle system producerer en mangfoldighed af hjernecelletyper, herunder glia- og mikroglielle celler, stamceller og neuroner i forhjernen, midthjernen og baghjernen. Organoider genereret fra denne protokol viser også kendetegnende for passende tidsmæssige og rumlige organisation demonstreret af brightfield billeder, histologi, immunfluorescens og real-time kvantitative omvendt transskription polymerase kædereaktion ( qRT-PCR). Fordi disse organoids indeholder celletyper fra forskellige dele af hjernen, kan de udnyttes til at studere et væld af sygdomme. For eksempel, i et nyligt papir, vi viste brugen af organoider genereret fra denne protokol til at studere virkningerne af hypoxi på den menneskelige hjerne. Denne tilgang kan bruges til at undersøge en række ellers vanskelige at studere tilstande som neurodevelopmental handicap, genetiske sygdomme, og neurologiske sygdomme.
Introduction
På grund af utallige praktiske og etiske begrænsninger har der været store problemer med at studere den menneskelige hjerne. Mens undersøgelser udnytte gnavere har været afgørende for vores forståelse af den menneskelige hjerne, musen hjernen har mange forskelle1,2. Interessant, mus har en neuronal tæthed, der er mindst 7 gange mindre end primat hjernen3,4. Selv om primater er tættere på mennesker end gnavere fra et evolutionært synspunkt, er det ikke praktisk for de fleste forskere at arbejde med dem. Formålet med denne protokol var at opsummere mange vigtige træk ved den menneskelige hjerne ved hjælp af en forenklet og billigere metode uden behov for en heterolog kælder membran matrix eller udefrakommende vækstfaktorer og samtidig opretholde hjernecelle mangfoldighed og cellulære organisation.
Formative arbejde fra Sasai lab brugt serum fri kultur embryoid organer (SFEBq) metode til at generere to- og tre-dimensionelle neuronal celletyper fra signalerede embryonale stamceller (EFC)5,6. Mange menneskelige hjerne organoid metoder har fulgt en forholdsvis lignende vej fra signalerede ECs7,8. I modsætning hertil starter denne protokol med klynger af fritliggende menneskelige EPC'er (HC'er), svarende til de første trin i skelsættende arbejde i Thomson og Zhang laboratorier forud for plating trin9,10 samt det første skridt i hjernen organoid protokol pasca laboratorium før tilsætning af udefrakommende vækstfaktorer11. Kælder membran matricer (f.eks matrigel) er blevet udnyttet i mange hjernen organoid protokoller, og det har vist sig at være en effektiv stillads8. Men, mest almindeligt anvendte kælder membran matricer ikke kommer uden komplikationer, da de co-rense med ukendte mængder af vækstfaktorer med parti til batch variation under produktionen12. Desuden kan disse matricer komplicere billeddannelse, og øge risikoen for forurening og omkostninger.
Mens menneskelige hjerne organoids kan bruges til at besvare mange spørgsmål, der er visse begrænsninger at huske på. For det første, startende fra embryonale stamceller, organoider mere ligner umodne hjerner end alderen hjerner og som sådan kan ikke være ideelle modeller for sygdomme, der opstår i alderdommen, ligesom Alzheimers sygdom. For det andet, mens vores protokol fundet markører for forhjernen, midthjernen og hindbrain udvikling, som er nyttige til at studere effekten af en behandling eller sygdom på celler fra flere hjerne regioner i koncert, andre protokoller kan følges for at koncentrere sig om specifikke hjerne regioner13,14. Endelig, en anden begrænsning af organoid modeller er, at størrelse, mens den gennemsnitlige længde af en menneskelig hjerne ca 167 mm, hjernen organoids lavet ved brug af agitation vokse op til 4 mm8 og organoider dannet af denne protokol vokse til 1-2 mm ved 10 uger. Ikke desto mindre, denne protokol giver et vigtigt værktøj til at studere menneskelige hjernevæv og samspillet mellem flere celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vedligeholdelse af stamceller
- Vedligehold H9 HCESCs på et lag af vækstfaktor reduceret kælder membran matrix (se Tabellen over materialer, fremover blot benævnt matrix) i henhold til producentens anvisninger.
- For at belægge en 6-brønds plade eller en 10 cm fad, kombinere 100 μL matrix med 5,9 ml iskold Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM) /F12 medier. Wrap plader i paraffin film og opbevares natten over ved 4 °C. Brug dem næste dag til passaging celler efter den overskydende matrix / medier er indsugning.
- Kultur cellerne uge til uge på ca en 1:12 split ratio hver 7 dage. Opbevar cellerne ved hjælp af mTESR-1-medier i en 37 °C, lav iltinkubator (5% O2,5% CO2). Opdater medier dagligt. Ukrudt ud skelneceller fra kulturen mellem passager ved hjælp af glas værktøjer.
- H9 celler bør sendes fire til seks dage før udnytte dem til at producere organoider. Cellerne skal sendes ved ca. et forhold på 1:8 af celleklynger. For at gøre dette skal du starte med at skylle cellerne med DMEM F12-medier og adskille cellerne med et neutralt protease (f.eks. dispase, fremover kaldet protease), skylles med DMEM/F-12 og plade som 30-60 celleklynger på tværs af 4 plader (6-brønd eller 10 cm) ved ~20% samtidighed. To dage før høst, overgang dem til en regelmæssig kuvøse (21% O2,5% CO2). Plader bør nå ~ 80% sammenløb, når du starter organoid dannelse.
2. Dissociation af HC'erne for organoidkultur
- Aliquot protease-bestandens opløsning (5 U/ml).
BEMÆRK: Vi fryser typisk 1 ml aliquots ved -20 °C til brug over flere måneder. - Protease-opløsningen udvandes til arbejdskoncentrationen ved at tilsætte 1 ml lageropløsning plus 5 ml DMEM/F12 for hver 6-brønd eller 10 cm plade hESC' er.
- Aspirere og fjerne cellekultur medier, derefter dække hESCs med protease løsning. Placer plader i rugemaskine i 10-15 min eller indtil kanterne af kolonierne runde op og begynder at adskille fra matrixen.
- Vip pladen, aspirere proteaseopløsningen, og vask forsigtigt cellerne med DMEM/F12 tre gange. Brug 2 ml/brønd til hver vask, når der anvendes en 6-brøndsplade og 6 ml, når der anvendes en 10 cm plade. Sørg for, at kolonier forbliver fastgjort til matrixen, når du udfører dette trin.
- Tilføj tilbage omkring 1,5 ml frisk mTESR medier til hver brønd (eller 5 ml for en 10 cm plade) og skyl cellerne ud af pladen ved hjælp af blid pipettering.
- Brug en 10 ml pipette, forsigtigt aspirere og dispensere hESC i pladen, indtil de når ca 1/30th af deres oprindelige størrelse. Koloniklynger skal ligne kvadrater på ~250-350 μm størrelse ved afslutningen af disse trin.
3. Generation af organoider
- Overfør celler til en enkelt ultralav vedhæftet fil T75 kolbe, der indeholder 30 ml mTESR-medier uden grundlæggende fibroblastvækstfaktor (bFGF).
- Den næste dag, vippe kolben (r), således at levende celler pool i hjørnet (dette kan tage 5-10 min på den første dag, men vil blive hurtigere som klynger bliver større).
BEMÆRK: Hvis der er et stort antal celler, der har klæbet til bunden af kolben på dette trin eller efterfølgende trin, skal du overføre cellerne til en ny kolbe. Det er normalt at have en høj population af døde celler i de første to dage. Når du udfører medieændringer, skal du sørge for at fjerne så meget af celleresterne som muligt. - Når cellerne bosætte sig, aspirere off medierne og døde celler forlader omkring 10 ml medier, der indeholder levende celler.
- Tilføj ~20 ml lav bFGF media (DMEM/F12 suppleret med 1x N2, 1x B27, 1x L-glutamin, 1x NEAA, 0,05% kvæg serum albumin (BSA), og 0,1 mM monothioglycerol (MTG) suppleret med 30 ng/mL bFGF).
- Tjek cellerne på dag 2. Hvis de fleste af cellerne ser sunde og lyse, er der ingen grund til at gøre noget. Men hvis mere end en tredjedel af cellerne ser mørke ud, skal mediet udskiftes (med samme vippeteknik som i trin 3.2) med ~20 ml lav bFGF-medie suppleret med 20 ng/mL bFGF.
- På dag 3, erstatte halvdelen af medierne (ved hjælp af vippe teknik i trin 3.2) med 20 ml af lav bFGF medier suppleret med 10 ng/mL bFGF.
- På dag 5 skal halvdelen af mediet udskiftes (ved hjælp af vippeteknikken i trin 3.2) med 20 ml neurale induktionsmedier (NIM: DMEM/F12, 1x N2 supplement, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/ml heparin).
BEMÆRK: Hvis der er store klynger af celler eller organoider, der er meget større end de andre, bør de fjernes fra kulturen. Størrelsen er anslået ved udseende under mikroskopet; ved hjælp af et okular med reticle. Størstedelen af organoiderne er på samme størrelse (ca. 100 ± 20 μm). Vi fjernede organoider, der var ca. 2 x mindre eller større end de andre. - Udskift halvdelen af mediet (~15 ml) (ved hjælp af vippeteknikken) med NIM hver anden dag.
- Efter 3 ugers kultur tilsættes 100x penicillin/streptomycin til mediet (NIM: DMEM/F12, 1x N2 supplement, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/ml heparin) ved en endelig koncentration på 1x, hvis det ønskes. Opdater mediet hver anden dag.
BEMÆRK: På denne måde fastholdt vi organoiderne i op til 6 måneder i kultur.
4. RNA-ekstraktion og -tilberedning
- Ekstrakt forsigtigt ca. 15 organoider (afhængigt af størrelse) fra kolben ved hjælp af en 10 ml pipette og placeres i et 1,5 ml rør.
- Træn organoiderne forsigtigt i centrifugen (200 x g i 1 min), og skyl med 1x Dulbeccos PBS (DPBS) tre gange.
- Uddrag RNA ved hjælp af valideret system eller protokol (f.eks. RNeasy-sættet).
- Mål den optiske massefyldesværdi for hver prøve ved 260 og 280 nm.
- Forbered cDNA ved hjælp af et valideret system eller protokol (f.eks. iScript cDNA-syntesesæt).
- Udfør qRT-PCR ved hjælp af forudvaliderede primere (tabel 1), herunder mindst ét rengøringsgen.
5. Immunhistokemi
- Fiksering
- Der fremstilles en 4% paraformaldehydopløsning (PFA), og den anbringes ved 4 °C.
- Brug en steril barbermaskine, afskære spidsen af en steril overførsel pipette.
- Træk forsigtigt organoider ud ved hjælp af den afskårne overførselspipetteret, da de let kan brydes fra hinanden, især når de bliver store, og læg dem i en 6-brønds plade med ekstra medier eller DPBS.
- Vip pladen, aspirer mediet, og udskift med 1x DPBS. Skyl cellerne med 1x DPBS to gange mere.
- Udskift DPBS med 4% PFA-opløsning, og anbring en shaker ved 4 °C.
BEMÆRK: Mens vi fast i 2 dage (for små organoider) til 7 dage (for organoids > 3 måneder), kortere gange (f.eks 16-24 h) kan også være muligt. - Forbered 30%, 20% og 10% saccharose løsninger i DPBS.
- Efter fiksering i PFA skal den erstattes med 10 % saccharoseopløsningen og anbringes på en shaker ved 4 °C i 24 timer.
- 10% saccharose med 20% saccharose og placeres på en shaker ved 4 °C i 24 timer.
- 20% saccharose med 30% saccharose og placeres på en shaker ved 4 °C i 24 timer.
- Frosne sektioner
- Forbered et fladt lag tøris og placere en mærket plast skimmel på toppen af det.
- Hæld et tyndt lag af optimalskæring temperatur medium (OCT) i formen og lad det begynde at hærde (inden for et par sekunder).
- Placer et par organoider på toppen af OLT i formen ved hjælp af en overførsel pipette med spidsen afskåret og være meget opmærksomme på placeringen af organoids.
- Langsomt tilføje i OCT, indtil formen er fuld, og organoids er dækket. Lad det hærde helt i yderligere 10 min.
BEMÆRK: Mens frysning over 10 min hjælper med at sikre ideel relativ placering af flere organoider til skæring, er det muligt at bruge en ethanol-tør is mix eller flydende kvælstof til at fryse hurtigere. - Marker den relative placering af organoiderne med en markør for at gøre det lettere at finde dem, når der skæres.
- Placer forme i en pose eller kasse og opbevares ved -80 °C, indtil de er klar til at skære sektionerne.
- Ved hjælp af en kryoostat skæres 10 μm sektioner og læg vævet på mærkede, positivt ladede dias.
- Farvning
- Forbered blokeringsopløsning (0,3% Triton X-100, 4% normalt æselserum i PBS).
- Brug en hydrofob pap pen til at trække rundt om omkredsen af vævet.
- Skyl diasene med PBS 3 gange i 5 minutter hver.
- Udskift PBS med blokeringsopløsning i 1 time ved stuetemperatur.
- Blokeringsopløsningen udikles med antistofopløsning (antistof ved passende koncentration, 0,1% Triton X-100, 4% normalt æselserum i PBS) ved 4 °C natten over.
- Den følgende dag vaskes diaset 3 gange med PBS i 10 minutter hver.
- PBS udvandes med det relevante sekundære antistof (ved passende koncentration) fortyndet i antistofopløsning i 1 time ved stuetemperatur.
- Skyl 3 gange i 10 minutter hver gang med 1x PBS.
- Påfør 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) pletten og skyl tre gange i 10 minutter hver med 1x PBS.
- Anbring dæksedler foran på diasene med monteringsopløsning, lad tørre ved stuetemperatur i mørke og opbevares i mørke ved 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser repræsentative brightfield billeder af flere tidspunkter for at demonstrere, hvordan cellerne / organoider ser ud i de forskellige faser af protokollen. Hcipc'erne blev fjernet fra vævskulturpladen, opdelt i små stykker og placeret i en T75 ultralav fastgørelseskolbe, hvor de dannede kugler. Det er vigtigt at bemærke, at cellerne ser lyse og lignende i størrelse, uden mørke, døende celler i midten af disse klynger. Cellerne blev gradvist vænnet fra bFGF. På dag 5 blev de placeret i neurale induktionsmedier, og de forblev i dette medie i hele kulturperioden. Selv om organoids bliver større og dermed mørkere over tid, er det vigtigt at tage til efterretning af neurale roset-lignende strukturer (sorte pile), der er til stede i hele hjernen organoid udvikling og udvide. Rossetterne indikerer indledningen af neural differentiering og indeholder funktioner i det embryonale neuralrør, der viser epitelegenskaber og omgiver et apical lumen15.
Farvning af organoider med hæmatoxylin og eosin på 5 måneder i kultur viste, at der ikke var store mængder af nekrose selv i centrene, hvilket var af indledende bekymring i betragtning af den stagnerende kultursystem(figur 2A). Disse organoider viste en histologisk morfologi svarende til den menneskelige cortex baseret på lys mikroskopisk evaluering af en erfaren neuropatolog (Figur 2B). Ved histologi, mange unikke celle morfoologier blev observeret ligner glia (blå pil hoved), neuroner (rød pilespids), celler med Cajal-Retzius morfologi (sorte pile), og neuropil (orange pilehoved)(Figur 2B,C).
For at se mere i dybden på genekspressionen i cellerne blev der udført qRT-PCR. For de resultater, der er vist i figur 3, repræsenterer hver søjle 3 separate partier af celler, der dyrkes uafhængigt og høstes på det angivne tidspunkt. Disse prøver blev derefter kørt i treeksemplarer med en primer par til det angivne gen et ud over husholdning genet, GAPDH. Den glutamattransportør, Vglut1 (figur 3A),blev udtrykt i 2,5 uger, steg med 5 uger og forblev konsekvent gennem 5 måneder i kultur. En forhjernen markør, Foxg1 (Figur 3B), blev udtrykt på lave niveauer indtil 5 uger i kultur. Den dybe lagmarkør, Tbr1 (figur 3C), toppede omkring 5 uger og faldt efterfølgende, mens den øverste lagmarkør, Satb2 (figur 3D),steg med tiden.
Udtrykket af ventralmærket Engrailed1 (Eng1) (figur 3E), baghjernen/rygmarvsmarkøren Hoxb4 (figur 3F) samt oligodendrocyte-markøren, Olig2 (figur 3G), steg alle med tiden. I modsætning hertil faldt stamcellemarkøren, Sox2 (figur 3H), over tid. Den glial markør, FAP (Figur 3I),toppede på 5 uger og forblev forholdsvis konstant efterfølgende. Desuden var immunfluorescensdata i overensstemmelse med qRT-PCR-dataene. På 10 uger var der en robust udtryk for Foxg1 (Figur 4A). Sox2-udtrykket var mere begrænset til områder, der lignede den subventrikulære zone (SVZ) (figur 4B,C). Interessant, der var også et udtryk for den ydre radiale glial celle markør, HopX (Figur 4D).
Figur 1: Oversigt over organoidvækstbetingelser og morfologi. (A) Skematisk af mediernes ændringer. (B-M) Repræsentative billeder af organoider, da de modnes. (B-M) H9 hESCs (B) blev udnyttet til at danne hjernen organoids. Organoider på (C) dag 2 i 20 ng/ml bFGF medier, og (D) dag 3 og (E) dag 4 i 10 ng/mL bFGF medier. (F-M) Organoider i neurale induktionmedier (NIM) på dag 5(F),8(G),10 (H), 17(I)35(J, K), og 70(L,M). Pile peger på neurale rosetter. Skalabjælke = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Organoids delte histologiske ligheder med humant hjernevæv. H & E farvning af organoids på 5 måneder(A)med nogle lagdeling ligner den menneskelige cortex(B). Ved højere forstørrelse blev mange cellemorfoster observeret, herunder glia (blå pilehoved), neuroner (rød pilespids), neuropil (orange pilehoved) og celler med Cajal-Retzius morfologi (sorte pile)(B,C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Ekspression af neurodevelopmental gener i hjernen organoids over tid. Kvantitative RT-PCR-data ved hjælp af SYBR grøn, der evaluerer udtrykket Vglut1 (A),Foxg1 (B), Tbr1 (C), Satb2 (D), En1 (E), Hoxb4 (F), Olig2 (G), Sox2 (H) og GFAP (I). Fejllinjer = middel ± standardafvigelse (n ≥ 3). Dette tal er blevet ændret fra16. Se tabel 1 for at få oplysninger om primer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Ekspression af neurodevelopmental proteiner i hjernen organoids på 10 uger. Immunfluorescens afslørede et robust udtryk for Foxg1 (A), lokaliseret udtryk for Sox2 (B,C) og tilstedeværelsen af HopX (D). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Gen | Sekvens (5' til 3') | Amplikon | Exon | |
| En1 (En1) | F | GGACAATGACGTTGAAA CGCAGCA |
149 | 2 |
| R | AAGGTCGTAAGCGGTTTT GGCTAGA Delte et træk og samme |
2 | ||
| Foxg1 (Foxg1) | F | AGAAGAACGGCAAGTAC Gaga |
188 | 1 |
| R | TGTTGAGGGACAGATTG TGGC (TGGC) |
1 | ||
| GAPDH | F | ACCACAGTCCATGCCAT Cac |
449 | 8 |
| R | CACCACCCTGTTGCTGT Agcc |
9 | ||
| GFAP (GFAP) | F | AGAGATCCGCACGCAGT Atg |
80 | 4 |
| R | TCTGCAAACTTGGAGCG Gta |
5-Apr | ||
| Hoxb4 (Hoxb4) | F | AAAGCACCCTCTGACTG CCAGATA |
80 | 2 |
| R | ATGGGCACGAAAGATGA GGGAGA DELTE ET PAR M./ |
2 | ||
| Olig2 (Olig2) | F | CCCTGAGGCTTTTCGGA GCG (GCG) |
451 | 1 |
| R | GCGGCTGTTGATCTTGA GACGC (GACGC) |
2 | ||
| Satb2 | F | TAGCCAAAGAATGCCCT Ctc |
94 | 6 |
| R | AAACTCCTGGCACTTGG Ttg |
7 | ||
| Sox2 (Sox2) | F | CCCAGCAGACTTCACAT Gt |
150 | 1 |
| R | CCTCCCATTTCCCTCGT Ttt |
1 | ||
| Tbr1 (Tbr1) | F | GTCACCGCCTACCAGAA Cac |
101 | 4 |
| R | ACAGCCGGTGTAGATCG Tg |
6 | ||
| Vglut1 (Vglut1) | F | CAGAGTTTTCGGCTTTG CTATTG |
183 | 5-Apr |
| R | GCGACTCCGTTCTAAGG GTG |
6 |
Tabel 1: Primersekvenser, der anvendes til kvantitativ RT-PCR i figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Svarende til andre organoid modeller, dette er et kunstigt system, der kommer med flere forbehold. Selv om der var lidt batch til batch variation i form af generelle udtrykniveauer, individuelle organoider viste forskelle. F.eks. var placeringen af Sox-2-positive områder ikke identisk i alle organoider (figur 3). Mens qPCR er egnet til at lede efter generelle ændringer i partier af celler, yderligere teknikker såsom enkelt celle RNAseq vil blive udnyttet i fremtidige undersøgelser til at indsamle flere oplysninger på celle-for-celle basis. En anden begrænsning af dette system er, at det ikke integrerer vaskulatur i organoiderne, som det er sket i nogle af de nyere undersøgelser17,18,19. Overgangen til HCI'erne fra et miljø med lavt til højt iltindhold kan imidlertid i højere grad ligne den anaerobe til aerobe overgang i et embryon under udvikling.
De kritiske skridt i denne protokol er dannelsen af neurosfærerne samt den passende vedligeholdelse, herunder medieændringer med de rette kulturmedier for at sikre sunde celler og tilstrækkelige næringsstoffer til de voksende organoider uden overbelægning . For at foretage fejlfinding af utilstrækkelig cellespredning eller differentiering anbefaler vi at starte med et nyt parti af ePC'er med lav passage og frisklavede medier, herunder kosttilskud. Lejlighedsvis kan der være batch variation af reagenser og materialer. Således anbefaler vi at købe flere flasker reagenser såsom N2 og ultra-lav fastgørelse kolber, som er fra samme parti, så længe de kan udnyttes i en rimelig mængde tid.
I modsætning til mange andre hjerne organoid protokoller, denne metode bruger ikke en bioreaktor; i stedet forbliver cellerne relativt stagnerende bortset fra medieændringer. Dette svarer til tidligere arbejde med neurosfærer, som i sidste ende blev brudt fra hinanden for at gøre 2D neuronal kulturer20. I denne model cellerne holdes i et 3D-format og lov til at vokse i op til 6 måneder i kultur. Det blev konstateret, at når udnytte små klynger i stedet for at aggregere enkelte celler, at organoids så lysere, som vi fortolkes som mindre nekrotisk. Som tidligere rapporteret, når hjernen organoid klynger blev evalueret af histologi og immunfluorescens på 5 måneder, der var ingen oplagte områder af nekrose16. Selv fra små klynger af celler introducerer en lille sort i størrelsen af organoider dannet, de fleste af organoider var af nogenlunde samme størrelse.
Brugen af en heterolog kælder membran matrix og en bioreaktor har både fordele og ulemper. Visse celletyper, eller større hjerne organoids måske foretrækker vækst under en eller anden betingelse. Kældermembranmatricer eller andre hydrogeler kan være gavnligt at selektivt tilføje vækstfaktorer til bestemte regioner eller skabe specifikke forme. Selv om kældermembranmatricer har vist sig at understøtte tredimensional organisation og differentiering15, er det værd at understrege , at nogle af disse produkter har en dårligt defineret og variabel sammensætning , der omfatter mængder af vækstfaktorer12. Ud over at forenkle arbejdsgangen, mens dyrkning af hjernen organoids, fraværet af en kælder membran matrix kan også forbedre tre-dimensionelle billeddannelse teknikker.
Udviklingen af denne hjerne organoid model system tilbyder en ny tilgang til mange potentielle anvendelser. For eksempel, giftige fornærmelser som hypoxi, hyperglykæmi, hypercapnia, og infektion blandt andre, kan testes med dette system. Desuden kan neurodevelopmental lidelser undersøges med dette system ved at starte med enten genetisk modificerede stamceller eller patientspecifikke humane inducerede pluripotente stamceller (hPSCs). Evnen til at tilføje forskellige celletyper under organoid kultur giver også mulighed for at studere tumor-hjerne interaktioner. I betragtning af protokollens enkelhed og manglen på dyre specialmaterialer håber vi, at denne tilgang kan betragtes af laboratorier både inden for og uden for området som en potentiel metode med sine egne unikke fordele for yderligere at fremme dette hurtigt fremskridt og spændende disciplin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.G.K. er sab-medlem for Dansar IT og Gene-in-Cell.
Acknowledgments
Vi takker Yale Stem Cell Core (YSCC), og Yale Cancer Center (YCC) for hjælp. Vi takker Dr. Jung Kim for hans neuropatologi anmeldelse. Dette arbejde blev støttet af Connecticut Regenerative Medicine Research Fund, marts Dimes, og NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), Yale Cancer Center og Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) og en generøs ubegrænset gave fra Joseph og Lucille Madri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
References
- Northcutt, R. G.
- Roth, G. The Long Evolution of Brains and Minds. , Springer Netherlands. (2013).
- Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).
- Roth, G., Dicke, U.
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures. Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids. Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).
- Bergmann, S., et al. Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics. Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
- Pham, M. T., et al.
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
