Поколение свиных яичек органоидов с Testis Специфическая архитектура с использованием Microwell культуры
Summary
Здесь мы представляем протокол для воспроизводимого поколения свиных яичек органоидов с тестом специфической архитектуры тканей с использованием коммерчески доступной системы культуры микроколодцев.
Abstract
Органоиды представляют трехмерные структуры, состоящие из нескольких типов клеток, которые способны переопределять архитектуру тканей и функции органов in vivo. Формирование органоидов открыло различные возможности фундаментальных и трансляционных исследований. В последние годы органоиды яичек заинтересовались мужской репродуктивной биологией. Личикулярные органоиды позволяют изучать клеточные взаимодействия, развитие тканей и микросреду нишу зародышевых клеток и облегчают высокую пропускную способность наркотиков и скрининга токсичности. Метод необходим для надежного и воспроизводимого генерации яичек органоидов с testis специфической архитектуры тканей. Система культуры микроколодцев содержит плотный массив микроколодцев в форме пирамиды. Яичек клетки, полученные из допубертатных яичек центрифугируются в эти микроуэллы и культивируется для создания яичек органоидов с яичка конкретных архитектуры тканей и клеточных ассоциаций. Тысячи однородных органоидов могут быть созданы с помощью этого процесса. Протокол, представленный здесь, будет представлять широкий интерес для исследователей, изучающих мужское размножение.
Introduction
В последние годы наблюдается возрождение интереса к трехмерным (3D) органоидам. Различные органы, такие как кишечник1,желудок2,поджелудочная железа3,4,печень5,и мозг6 были успешно выведены в 3D органоидных систем. Эти органоиды имеют архитектурное и функциональное сходство с органами in vivo и более биологически актуальны для изучения микроокружения тканей, чем монослойные системы культуры7. В результате, органоиды яичек начали набирать интерес, а также8,9,10,11,12. Большинство методов сообщили до сих пор являются сложными, невысокой пропускной записи10 и требуют добавления ECM белков8,10. Эта сложность также приводит к проблемам с воспроизводимостью. Необходим простой и воспроизводимый метод, позволяющий выравлить органоиды яичек с клеточными ассоциациями, которые подобны яичкам in vivo.
Недавно мы сообщили о системе для удовлетворения этихтребований 12. Используя свинью в качестве модели, мы использовали центробежный подход к принудительной агрегации в системе микроколодцов. В системе микроколодцов, каждый из скважин содержит большое количество одинаковых небольших микровелл13. Это позволяет для генерации многочисленных сфероидов равномерного размера. Система микроскважин позволила пообразить большое количество однородных органоидов с архитектурой, специфичной для яичек. Система проста и не требует добавления белков ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы создали простой метод, который позволяет последовательное, повторяемое поколение большого количества яичек органоидов с архитектурой тканей, которая похожа на testis in vivo12. Хотя подход был разработан с использованием свиных яичек клеток, это более широко применимо также ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH/NICHD HD091068-01 доктору Ине Добрински.
Materials
| 100 mm ultra low attachment tissue culture dish | Corning | #CLS3262 | |
| 100 mm tissue culture dish | Corning | #353803 | |
| Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | #07010 | |
| Collagenase type IV from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | #C5138 | referred as Collagenase IV S |
| Collagenase type IV Worthington | Worthington-Biochem | #LS004189 | referred as Collagenase IV W |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 | Gibco | #11330-032 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | #236-EG | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | FisherScientific | #352350 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | FisherScientific | #352340 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | #41400-045 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
| Porcine testicular tissue | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada) | ||
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | #SCGP00525 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | #T4049 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Abbott, A. Cell culture: biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
- Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 82-82 (2018).
- Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
- Baert, Y., et al. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. , (2019).
- Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates. Journal of Visualized Experiments. (81), 50665 (2013).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
- González, R., Dobrinski, I. Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models. ILAR Journal. 56 (1), 83-98 (2015).
- Oatley, J. M., Brinster, R. L. The germline stem cell niche unit in mammalian testes. Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).
- Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development. Proceedings of the National Academy of Science USA. 113 (7), 1829-1834 (2016).
