Generación de organoides testiculares porcinos con arquitectura específica de Testis utilizando Microwell Culture
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la generación reproducible de organoides testiculares porcinos con arquitectura de tejido específica testis utilizando el sistema de cultivo de micropozos disponible comercialmente.
Abstract
Los organoides son estructuras tridimensionales compuestas por múltiples tipos de células que son capaces de recapitular la arquitectura tisular y las funciones de los órganos in vivo. La formación de organoides ha abierto diferentes vías de investigación básica y traslacional. En los últimos años, los organoides testiculares han despertado interés en el campo de la biología reproductiva masculina. Los organoides testiculares permiten el estudio de las interacciones celulares, el desarrollo de tejidos y el microambiente de nicho de células germinales y facilitan el cribado de toxicidad y fármacos de alto rendimiento. Se necesita un método para generar de forma fiable y reproducible organoides testiculares con una arquitectura de tejido específica para testículos. El sistema de cultivo de micropozos contiene una densa gama de micropozos en forma de pirámide. Las células testiculares derivadas de testículos prepúberes se centrifugan en estos micropozos y se cultivan para generar organoides testiculares con arquitectura de tejido específica de testículos y asociaciones celulares. Miles de organoides homogéneos se pueden generar a través de este proceso. El protocolo aquí reportado será de amplio interés para los investigadores que estudian la reproducción masculina.
Introduction
En los últimos años, ha habido un resurgimiento del interés en los organoides tridimensionales (3D). Diferentes órganos como intestino1, estómago2, páncreas3,4, hígado5, y cerebro6 se han derivado con éxito en sistemas de organoides 3D. Estos organoides tienen similitudes arquitectónicas y funcionales con los órganos in vivo y son más relevantes biológicamente para el estudio del microambiente tisular que los sistemas de cultivo monocapa7. Como resultado, los organoides testiculares han comenzado a interesar se ademásde8,9,10,11,12. La mayoría de los métodos reportados hasta ahora son complejos, no altos rendimiento10 y requieren la adición de proteínas ECM8,10. Esta complejidad también conduce a problemas de reproducibilidad. Se necesita un método sencillo y reproducible que permita la generación de organoides testiculares con asociaciones celulares que son como testículos in vivo.
Recientemente hemos informado de un sistema para abordar estos requisitos12. Utilizando el cerdo como modelo, empleamos un enfoque centrífugo de agregación forzada en el sistema de micropocillos. En el sistema de micropozos, cada pozo contiene un gran número de micropozos más pequeños idénticos13. Esto permite la generación de numerosos esferoides de tamaño uniforme. El sistema de microrwell permitió la generación de un gran número de organoides uniformes con una arquitectura específica de testis. El sistema es simple y no requiere la adición de proteínas ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos establecido un método sencillo que permite la generación consistente y repetible de grandes cantidades de organoides testiculares con arquitectura tisular que es similar a testis in vivo12. Mientras que el enfoque se desarrolló utilizando células testis porcinas, es más ampliamente aplicable también al ratón, primate no humano y testículo s-humano12. Se han notificado varios métodos diferentes para producir organoides testiculares8<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por NIH/NICHD HD091068-01 a la Dra. Ina Dobrinski.
Materials
| 100 mm ultra low attachment tissue culture dish | Corning | #CLS3262 | |
| 100 mm tissue culture dish | Corning | #353803 | |
| Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | #07010 | |
| Collagenase type IV from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | #C5138 | referred as Collagenase IV S |
| Collagenase type IV Worthington | Worthington-Biochem | #LS004189 | referred as Collagenase IV W |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 | Gibco | #11330-032 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | #236-EG | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | FisherScientific | #352350 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | FisherScientific | #352340 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | #41400-045 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
| Porcine testicular tissue | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada) | ||
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | #SCGP00525 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | #T4049 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Abbott, A. Cell culture: biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
- Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 82-82 (2018).
- Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
- Baert, Y., et al. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. , (2019).
- Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates. Journal of Visualized Experiments. (81), 50665 (2013).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
- González, R., Dobrinski, I. Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models. ILAR Journal. 56 (1), 83-98 (2015).
- Oatley, J. M., Brinster, R. L. The germline stem cell niche unit in mammalian testes. Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).
- Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development. Proceedings of the National Academy of Science USA. 113 (7), 1829-1834 (2016).
