Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analyse de la dimérisation Endogenous IRF5
Summary
Une méthode occidentale indigène de tache pour analyser le facteur réglementaire endogène d’interféron 5 dimerization dans la ligne de cellules dendritiques plasmacytoid de CAL-1 est décrite. Ce protocole peut également être appliqué à d’autres lignées cellulaires.
Abstract
Le facteur de régulation de l’interféron 5 (IRF5) est un facteur de transcription clé pour réguler la réponse immunitaire. Il est activé en aval de la voie de signalisation de la différence myéloïde de récepteur de péage 88 (TLR-MyD88). L’activation d’IRF5 implique la phosphorylation, la dimerisation, et la translocation suivante du cytoplasme dans le noyau, qui à son tour induit l’expression de gène de diverses cytokines pro-inflammatoires. Un test de détection pour l’activation iRF5 est essentiel à l’étude des fonctions IRF5 et de ses voies pertinentes. Cet article décrit un analyse robuste pour détecter l’activation endogène d’IRF5 dans la ligne humaine de cellules dendritiques deplasmacytoid de CAL-1. Le protocole consiste en un analyse d’électrophorèse non dénaturante modifiée qui permet de distinguer IRF5 dans ses formes monomères et dimères, offrant ainsi une approche abordable et sensible pour analyser l’activation de l’IRF5.
Introduction
Le facteur de régulation de l’interféron 5 (IRF5) est un important régulateur de transcription qui joue un rôle de premier plan dans la régulation de la réponse immunitaire, en particulier dans la libération de cytokines pro-inflammatoires et d’interférons de type I (IFN)1,2 ,3. La mauvaise régulation de l’IRF5 est un facteur contribuant à de nombreuses maladies auto-immunes, comme en témoignent les divers polymorphismes dans le locus IRF5 qui sont associés au lupus érythémateux systémique, à la sclérose en plaques, à la polyarthrite rhumatoïde, etc.4, 5,6,7,8,9,10. Par conséquent, un essai de détection robuste pour l’état d’activation endogène iRF5 est crucial pour comprendre les voies réglementaires et les effets en aval de l’IRF5 dans un contexte cellulaire physiologiquement pertinent.
IRF5 est constitutivement exprimé dans les monocytes, les cellules dendritiques (DC), les cellules B, et les macrophages1,11. Comme avec d’autres facteurs de transcription de famille d’IRF, IRF5 réside dans le cytoplasme dans son état latent. Lors de l’activation, IRF5 est phosphorylé et forme des homodimères, qui se translocalisent ensuite dans le noyau et se lient à des éléments réglementaires spécifiques des gènes codant les IFN de type I et les cytokines pro-inflammatoires, induisant éventuellement l’expression de ces gènes1 ,2,11,12,13. IRF5 régule les réponses immunitaires innées en aval de divers récepteurs de type Toll (TLR), tels que TLR7, TLR 8, et TLR 9, qui sont localisés en endosomes et utilisent MyD88 pour signaler1,11,14. Ces TLR reconnaissent principalement les espèces étrangères d’acide nucléique telles que l’ARN à brin unique (arDR) et l’ADN CPG non méthylé qui sont symptomatiques d’une infection15,16,17,18. IRF5 a été montré pour réguler les réponses immunitaires contre les infections bactériennes, virales et fongiques19,20,21. Compte tenu du rôle influent et diversifié de l’IRF5 dans le système immunitaire, l’amélioration ou l’amortissement de l’activité IRF5 pourrait servir de nouvelle voie pour le développement d’agents thérapeutiques22. Par conséquent, il est essentiel de développer un protocole pour surveiller l’état d’activation de l’IRF5 endogène pour permettre une étude approfondie des voies et des mécanismes régulant l’activité IRF5 dans différents types de cellules.
Au meilleur de notre connaissance, aucun analyse biochimique ou électrophoretic de gel pour l’activation endogène d’IRF5 n’a été édité avant le développement de ce protocole. La phosphorylation s’est avérée être une première étape importante de l’activation de l’IRF5, et un anticorps IRF5 phosphospecific a été développé qui a mené à la découverte et à la confirmation d’un résidu de sérine important pour l’activitéIRF5 13. Cependant, alors que l’anticorps détecte clairement iRF5 phosphorylé lorsqu’il est immunoprécipité ou surexprimé23, il ne détecte pas la phosphorylation IRF5 dans une cellule entière lysate dans nos mains (données non montrées). La dimérisation est la prochaine étape de l’activation de l’IRF5, et de nombreuses études importantes à ce jour sur lesquelles on s’est appuyée sur la surexpression de l’IRF5 étiqueté eilluant épitope, souvent dans des types de cellules non pertinentes qui n’expriment normalement pas IRF511,12 ,24,25. Des études antérieures ont montré que l’IRF5 dimérisé ne peut pas toujours se translocaliser dans le noyau et n’est donc pas nécessairement pleinement activé25,26. Un essai pour la localisation nucléaire endogène D’IRF5 a été développé pour évaluer l’activation d’IRF5 par la cytométrie de flux d’imagerie27. Cet essai a été appliqué dans des études qui ont été cruciales pour comprendre l’activité IRF5, en particulier dans les types de cellules primaires ou rares28,29 et a grandement avancé les connaissances dans le domaine. Cependant, cet exemple repose sur un instrument spécialisé qui n’est pas largement disponible pour les chercheurs. En outre, il est souvent nécessaire d’étudier les premières étapes de l’activation tout en disséquant les voies réglementaires IRF5 et en identifiant les régulateurs en amont et les composantes de la voie. Cette étude fournit un analyse biochimique robuste et fiable pour les événements d’activation précoce de l’IRF5 qui peut être effectuée dans des laboratoires équipés d’outils de biologie moléculaire. Le protocole décrit ici sera très utile dans l’étude des voies et des mécanismes des actions IRF5, en particulier lorsqu’il est combiné avec des essais orthogonaux tels que l’analyse cytométrique flux d’imagerie de la localisation nucléaire IRF523, 27,28,30.
L’électrophoresis de gel de polyacrylamide indigène (PAGE indigène) est une méthode largement utilisée pour analyser des complexes de protéine31,32. Contrairement à l’électrophorèse de gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE), PAGE indigène sépare les protéines en fonction de leur forme, de leur taille et de leur charge. Il conserve également la structure indigène de protéine sans dénaturation31,33,34,35. Le protocole présenté tire parti de ces caractéristiques de page native et détecte les formes monomériques et dimériques de l’IRF5. Cette méthode est particulièrement importante pour détecter les événements d’activation précoce parce qu’il n’existe aucun anticorps disponible dans le commerce qui puisse détecter l’IRF5 phosphorylé endogène. Auparavant, plusieurs études publiées utilisaient page native pour évaluer la dimerisation IRF5. Cependant, la majorité de ces études dépendaient de la surexpression de l’IRF5 exogène étiqueté eépitore pour analyser le statut d’activation2,13,24,36,37 . Ce travail présente un protocole étape par étape pour l’analyse de la dimérisation iRF5 endogène via une technique PAGE indigène modifiée dans une lignée de cellules dendritiques plasmacytoïdes humaines (pDC), où l’activité IRF5 s’est avérée cruciale pour sa fonction1, 38,39,40. Cette même technique a été appliquée à d’autres lignéescellulaires 23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici est un PAGE indigène modifié qui distingue les formes monomeric et dimériques de l’IRF5 endogène. Il y a eu peu d’études rapportant la détection de l’activation endogène d’IRF5 utilisant la technique spécialisée de cytométrie de flux d’imagerie23,27,28,30. Ce protocole utilise une technique commune et des réactifs et des outils communs pour évaluer l’état d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux ont été soutenus par des fonds de la Fondation Croucher et des fonds de démarrage de l’Université de la Ville. Nous remercions tous les membres du laboratoire Chow pour leur aide dans l’expérience et la lecture critique du manuscrit.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies, HK | 21985023 | |
| 300 W/250 V power supply 230 V AC | Life Technologies, HK | PS0301 | |
| Anti-IRF5 antibody | Bethyl Laboratories, USA | A303-385 | |
| BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) | EcoLife, HK | MR-12 | |
| EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4 X 100 mL | Life Technologies | 15575020 | |
| Glycerol 500 mL | Life Technologies | 15514011 | |
| Glycine | Life Technologies, HK | 15527013 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 610-145-002-0.5 | |
| Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 611-145-002-0.5 | |
| Halt protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, HK | 78430 | |
| HEPES | Life Technologies, HK | 15630080 | |
| LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Gene Company, HK | 927-50000 | |
| Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories | Life Technologies, HK | NW2000 | |
| NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit | Life Technologies, HK | BN1001BOX | |
| NativePAGE Running Buffer 20x | Life Technologies, HK | BN2001 | |
| NativePAGE Sample Buffer 4x | Life Technologies, HK | BN2003 | |
| NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol | Tin Hang/Calbiochem, HK | #492016-100ML | |
| PBS 7.4 | Life Technologies, HK | 10010023 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Bio-gene/Merck Millipore, HK | IPFL00010 | |
| Protein assay kit II (BSA) | Bio-Rad, HK | 5000002 | |
| R848 | Invivogen, HK | tlrl-r848 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies, HK | 61870127 | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | BP358-1 | |
| Sodium deoxycholate ≥97% (titration) | Tin Hang/Sigma, HK | D6750-100G | |
| Tris | Life Technologies, HK | 15504020 | |
| TWEEN 20 | Tin Hang/Sigma, HK | #P9416-100ML |
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