Análise imunoblot da electroforese do gel do polyacrylamide nativo da dimerization IRF5 endógena
Summary
Um método ocidental nativo do borrão para analisar o dimerização regulador endógeno do fator 5 do interferon na linha de pilha dendríticas do plasmacytoid Cal-1 é descrito. Este protocolo pode ser aplicado a outras linhas de célula também.
Abstract
O fator regulador 5 do interferon (IRF5) é um fator chave da transcrição para regular a resposta imune. É ativado a jusante da via de sinalização do gene de resposta primária 88 (TLR-MyD88) da diferenciação Myeloid do receptor Toll-like. A ativação do IRF5 envolve a fosforilação, a dimerização e a subsequente translocação do citoplasma para o núcleo, que por sua vez induz a expressão gênica de várias citocinas pró-inflamatórias. Um ensaio de detecção para ativação IRF5 é essencial para estudar funções IRF5 e seus caminhos relevantes. Este artigo descreve um ensaio robusto para detectar a ativação IRF5 endógena na linha de célula dendrítica do plasmacytoid humano de CAL-1 (pDC). O protocolo consiste em um ensaio de eletroforese não desnaturante modificado que pode distinguir IRF5 em suas formas de monómero e dímero, proporcionando assim uma abordagem acessível e sensível para analisar a ativação do IRF5.
Introduction
O fator de regulação do interferão 5 (IRF5) é um importante regulador de transcrição que desempenha um papel proeminente na regulação da resposta imune, particularmente na liberação de citocinas pró-inflamatórias e interferões tipo I (ifns)1,2 ,3. A desregulação do IRF5 é um fator contribuinte em inúmeras doenças auto-imunes, como evidente por vários polimorfismos no locus IRF5 que estão associados com lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla, artrite reumatóide, etc.4, 5,6,7,8,9,10. Portanto, um ensaio de detecção robusto para o estado de ativação IRF5 endógena é crucial para compreender as vias reguladoras e os efeitos a jusante da IRF5 em um contexto celular fisiologicamente relevante.
IRF5 é constitutivamente expresso em monócitos, células dendríticas (DCs), células B emacrófagos,11. Como com outros fatores da transcrição da família de IRF, IRF5 reside no citoplasma em seu estado latente. Após a ativação, o IRF5 é fosforilado e forma homodimers, que então translocam para o núcleo e se ligam a elementos regulatórios específicos de genes codificadores tipo I IFNs e citocinas pró-inflamatórias, eventualmente induzindo a expressão desses genes1 ,2,11,12,13. IRF5 regula as respostas imunes inatas a jusante de vários receptores de pedágio (TLRs), como TLR7, TLR 8 e TLR 9, que estão localizados em endossomos e usam MyD88 para sinalização1,11,14. Estes TLRs reconhecem primeiramente espécies de ácido nucleico extrangeiro tais como o RNA único-encalhado (ssrna) e o ADN unmethylated do CPG que são sintomáticos de uma infecção15,16,17,18. IRF5 foi demonstrado para regular as respostas imunes contra infecções bacterianas, virais e fúngicas19,20,21. Considerando IRF5’s papel influente e diversificado no sistema imunológico, potencializando ou umedecendo a atividade IRF5 poderia servir como uma nova avenida para o desenvolvimento de agentes terapêuticos22. Portanto, é fundamental desenvolver um protocolo para monitorar o status de ativação do IRF5 endógeno para permitir uma investigação minuciosa das vias e mecanismos que regulam a atividade IRF5 em diferentes tipos de células.
Ao melhor de nosso conhecimento, nenhum ensaio electrophoretic bioquímico ou do gel para a ativação IRF5 endógena foi publicado antes do desenvolvimento deste protocolo. O phosphorylation foi mostrado para ser um primeiro passo importante da ativação IRF5, e um anticorpo IRF5 phosphospecific foi desenvolvido que conduziu à descoberta e à confirmação de um resíduo serina importante para a atividade IRF513. Entretanto, quando o anticorpo detectar claramente o IRF5 fosforilada quando Immunoprecipitated ou overexpressado23, não detecta a fosforilação IRF5 em um lisado inteiro da pilha em nossas mãos (dados não mostrados). A dimerização é a próxima etapa da ativação do IRF5, e muitos estudos importantes até o momento investigando este passo dependiam da superexpressão de IRF5 com a tag epitope, muitas vezes em tipos de células irrelevantes que normalmente não expressam IRF5,11,12 ,24,25. Estudos prévios mostraram que a IRF5 dimerizada nem sempre pode ser translocada para o núcleo e, portanto, não é necessariamente totalmente ativada25,26. Um ensaio para a localização nuclear IRF5 endógena foi desenvolvido para avaliar a ativação IRF5 pelo fluxo de imagem citometria27. Este ensaio tem sido aplicado em estudos que foram cruciais para a compreensão da atividade IRF5, especialmente nos tipos de células primárias ou raras28,29 e avançou grandemente o conhecimento no campo. No entanto, este ensaio baseia-se em um instrumento especializado que não está amplamente disponível para os pesquisadores. Além disso, muitas vezes é necessário investigar os passos iniciais de ativação, enquanto dissecando IRF5 vias reguladoras e identificando os reguladores upstream e componentes da via. Este estudo fornece um ensaio bioquímico robusto e confiável para os eventos de ativação precoce de IRF5 que podem ser realizados em laboratórios equipados com ferramentas de biologia molecular. O protocolo aqui descrito será muito útil na investigação das vias e mecanismos das ações IRF5, especialmente quando combinados com ensaios ortogonais como a análise citométrica do fluxo de imagem da localização nuclear de IRF523, 27,28,30.
A electroforese nativa do gel do poliacrilamida (página nativa) é um método amplamente utilizado para analisar complexos da proteína31,32. Ao contrário do dodecylsulfate do sódio a electroforese do gel do poliacrilamida (SDS-PAGE), página nativa separa proteínas com base em seus forma, tamanho, e carga. Igualmente retém a estrutura nativa da proteína sem desnaturação31,33,34,35. O protocolo apresentado aproveita esses recursos da página nativa e detecta formas monoméricas e diméricas de IRF5. Este método é particularmente importante para a detecção de eventos de ativação precoce, pois não há nenhum anticorpo comercialmente disponível adequado que possa detectar a IRF5 fosforilada endógena. Anteriormente, vários estudos publicados utilizavam a página nativa para avaliar a dimerização do IRF5. No entanto, a maioria desses estudos dependeu da superexpressão do epítopo exógeno-Tagged IRF5 para analisar o status de ativação2,13,24,36,37 . Este trabalho apresenta um protocolo passo-a-passo para analisar a dimerização endógena de IRF5 por meio de uma técnica de página nativa modificada em uma linha de células dendríticas de plasmacitoides humanas (pDC), onde a atividade de IRF5 demonstrou ser crucial para sua função1, 38,39,40. Esta mesma técnica foi aplicada a outras linhas celulares23.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui é uma página nativa modificada que distingue formas monoméricas e diméricas de IRF5 endógenas. Há poucos estudos relatando a detecção da ativação endógena de IRF5 utilizando a técnica de citometria de fluxo de imagem especializada23,27,28,30. Este protocolo usa uma técnica comum e reagentes e ferramentas comuns para avaliar o estado de ativação IRF5 end?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi apoiado pelo financiamento dos fundos de arranque da Fundação Croucher e da City University. Agradecemos a todos os membros do laboratório Chow por ajuda com o experimento e leitura crítica do manuscrito.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies, HK | 21985023 | |
| 300 W/250 V power supply 230 V AC | Life Technologies, HK | PS0301 | |
| Anti-IRF5 antibody | Bethyl Laboratories, USA | A303-385 | |
| BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) | EcoLife, HK | MR-12 | |
| EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4 X 100 mL | Life Technologies | 15575020 | |
| Glycerol 500 mL | Life Technologies | 15514011 | |
| Glycine | Life Technologies, HK | 15527013 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 610-145-002-0.5 | |
| Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 611-145-002-0.5 | |
| Halt protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, HK | 78430 | |
| HEPES | Life Technologies, HK | 15630080 | |
| LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Gene Company, HK | 927-50000 | |
| Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories | Life Technologies, HK | NW2000 | |
| NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit | Life Technologies, HK | BN1001BOX | |
| NativePAGE Running Buffer 20x | Life Technologies, HK | BN2001 | |
| NativePAGE Sample Buffer 4x | Life Technologies, HK | BN2003 | |
| NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol | Tin Hang/Calbiochem, HK | #492016-100ML | |
| PBS 7.4 | Life Technologies, HK | 10010023 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Bio-gene/Merck Millipore, HK | IPFL00010 | |
| Protein assay kit II (BSA) | Bio-Rad, HK | 5000002 | |
| R848 | Invivogen, HK | tlrl-r848 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies, HK | 61870127 | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | BP358-1 | |
| Sodium deoxycholate ≥97% (titration) | Tin Hang/Sigma, HK | D6750-100G | |
| Tris | Life Technologies, HK | 15504020 | |
| TWEEN 20 | Tin Hang/Sigma, HK | #P9416-100ML |
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