अंतर्जात इंटरफेरॉन नियामक कारक 5 CAL-1 प्लाज्मा साइटोइड डेन्ड्रिटिक सेल लाइन में dimerization का विश्लेषण करने के लिए एक देशी पश्चिमी धब्बा विधि का वर्णन किया गया है। इस प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से अन्य सेल लाइनों के लिए लागू किया जा सकता है.
इंटरफेरॉन नियामक कारक 5 (IRF5) प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित करने के लिए एक प्रमुख प्रतिलेखन कारक है. यह टोल की तरह रिसेप्टर माइलॉयड भेदभाव प्राथमिक प्रतिक्रिया जीन 88 (TLR-MyD88) संकेतन मार्ग के बहाव सक्रिय है. IRF5 सक्रियण फॉस्फोरिलेशन शामिल है, dimerization, और बाद में कोशिका द्रव्य से नाभिक में स्थानांतरण, जो बदले में विभिन्न समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के जीन अभिव्यक्ति लाती है. IRF5 सक्रियण के लिए एक का पता लगाने परख IRF5 कार्यों और उसके संबंधित रास्ते का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है. यह लेख CAL-1 मानव प्लाज्मा cytoid डेन्ड्रिटिक सेल (pDC) लाइन में अंतर्जात IRF5 सक्रियण का पता लगाने के लिए एक मजबूत परख का वर्णन करता है. प्रोटोकॉल एक संशोधित nondenaturing electrophoresis परख है कि अपने monomer और dimer रूपों में IRF5 भेद कर सकते हैं के होते हैं, इस प्रकार IRF5 सक्रियण का विश्लेषण करने के लिए एक सस्ती और संवेदनशील दृष्टिकोण प्रदान.
इंटरफेरॉन नियामक कारक 5 (IRF5) एक महत्वपूर्ण प्रतिलेखन नियामक है जो प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित करने में एक प्रमुख भूमिका निभाता है, विशेष रूप से समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स और प्रकार मैं इंटरफेरॉन्स (IFNs)1,2 ,3. आईआरएफ 5 का गलत विनियमन कई ऑटोम्यून्यून रोगों में एक योगदान कारक है, जैसा कि आईआरएफ5 टिड्डी में विभिन्न बहुरूपता से स्पष्ट है जो प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमेटोसस, मल्टीपल स्क्लेरोसिस, रूमेटोइड गठिया आदि के साथ जुड़े हुए हैं। 5,6,7,8,9,10. इसलिए, अंतर्जात IRF5 सक्रियण राज्य के लिए एक मजबूत पता लगाने परख एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक सेलुलर संदर्भ में नियामक रास्ते और IRF5 के बहाव प्रभाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण है.
IRF5 एककोशिकाओं, डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं (डीसी), बी कोशिकाओं, और मैक्रोफेज1,11में व्यक्त किया जाता है। अन्य आईआरएफ परिवार प्रतिलेखन कारकों के साथ के रूप में, IRF5 अपनी गुप्त राज्य में कोशिका द्रव्य में रहता है. सक्रियण पर, IRF5 फॉस्फोरीलेटाइज्ड है और होमोडीमर बनाता है, जो फिर नाभिक में स्थानांतरित हो जाता है और जीन एन्कोडिंग प्रकार I IFNs और समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के विशिष्ट विनियामक तत्वों को बांधता है, अंततः इन जीनों की अभिव्यक्ति को प्रेरित करताहै 1 ,2,11,12,13. IRF5 विभिन्न टोल की तरह रिसेप्टर्स (TLRs), जैसे TLR7, TLR 8, और TLR 9, जो endosomes में स्थानीयकृत कर रहे हैं और संकेत1,11,14के लिए MyD88 का उपयोग की जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करता है. ये टीएलआर मुख्य रूप से विदेशी न्यूक्लिक एसिड प्रजातियों को पहचानते हैं जैसे कि एकल-स्ट्रेंडेड आरएनए (एसआरएनए) और अमेथिलित सीपीजी डीएनए जो संक्रमण का लक्षण15,16,17,18हैं । IRF5 जीवाणु, वायरल, और फंगल संक्रमण के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है19,20,21. प्रतिरक्षा प्रणाली में आईआरएफ5 की प्रभावशाली और विविध भूमिका को ध्यान में रखते हुए, आईआरएफ 5 गतिविधि को बढ़ाने या गीला करने से चिकित्सीय एजेंटों के विकास के लिए एक उपन्यास अवसर के रूप में काम कर सकता है22. इसलिए, यह अंतर्जात IRF5 के सक्रियण की स्थिति की निगरानी करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है रास्ते और विभिन्न सेल प्रकार में IRF5 गतिविधि को विनियमित तंत्र की पूरी तरह से जांच की अनुमति देने के लिए.
हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, अंतर्जात IRF5 सक्रियण के लिए कोई जैव रासायनिक या जेल electrophoretic परख इस प्रोटोकॉल के विकास से पहले प्रकाशित किया गया है. Phosphorylation IRF5 सक्रियण का एक महत्वपूर्ण पहला कदम होना दिखाया गया है, और एक phosphospecific IRF5 एंटीबॉडी है कि खोज और IRF5 गतिविधि13के लिए महत्वपूर्ण एक serine अवशेषों की पुष्टि करने के लिए नेतृत्व किया गया था. हालांकि, जबकि एंटीबॉडी स्पष्ट रूप से फॉस्फोरीलेट IRF5 का पता लगाता है जब इम्यूनोप्रिसिटाइज या overexpressed23, यह हमारे हाथों में एक पूरी सेल lysate में IRF5 फॉस्फोरिलेशन का पता लगाने में विफल रहता है (डेटा नहीं दिखाया). Dimerization IRF5 सक्रियण का अगला कदम है, और इस कदम की जांच करने के लिए कई महत्वपूर्ण अध्ययन epitope-टैग IRF5 के overexpression पर भरोसा किया, अक्सर अप्रासंगिक सेल प्रकार है कि आम तौर पर IRF511व्यक्त नहीं करते में,12 ,24,25. पिछले अध्ययनों से पता चला है कि dimerized IRF5 हमेशा नाभिक में स्थानांतरित नहीं हो सकता है और इसलिए जरूरी नहीं कि पूरी तरह से सक्रिय25,26. इंजिंग आईआरएफ5 परमाणु स्थानीयकरण के लिए एक परख इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री27द्वारा आईआरएफ5 सक्रियण का आकलन करने के लिए विकसित किया गया था . यह परख अध्ययन है कि IRF5 गतिविधि को समझने के लिए महत्वपूर्ण थे में लागू किया गया है, विशेष रूप से प्राथमिक या दुर्लभ सेल प्रकार में28,29 और बहुत क्षेत्र में ज्ञान उन्नत. हालांकि, इस परख शोधकर्ताओं के लिए व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं है कि एक विशेष साधन पर निर्भर करता है. इसके अलावा, आईआरएफ5 विनियामक मार्गों को विभाजित करते समय सक्रियण के प्रारंभिक चरणों की जांच करना और अपस्ट्रीम विनियामकों और मार्ग घटकों की पहचान करना अक्सर आवश्यक होता है। इस अध्ययन IRF5 के प्रारंभिक सक्रियण घटनाओं है कि आणविक जीव विज्ञान उपकरण ों से लैस प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है के लिए एक मजबूत और विश्वसनीय जैव रासायनिक परख प्रदान करता है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल रास्ते और IRF5 कार्यों के तंत्र की जांच में बहुत उपयोगी हो जाएगा, खासकर जब इस तरह के IRF5 परमाणु स्थानीयकरण23के इमेजिंग प्रवाह cytometric विश्लेषण के रूप में orthogonal assays के साथ संयुक्त, 27,28,30.
देशी polyacrylamide जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (देशी पेज) प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है31,32. सोडियम dodecylsulfate polyacrylamide जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (एसडीएस-पेज) के विपरीत, देशी पेज उनके आकार, आकार, और चार्ज के आधार पर प्रोटीन को अलग करता है। यह भी विकृतीकरण के बिना देशी प्रोटीन संरचना को बनाए रखता है31,33,34,35. प्रस्तुत प्रोटोकॉल देशी पृष्ठ की इन सुविधाओं का लाभ लेता है और IRF5 के दोनों monomeric और dimeric रूपों का पता लगाता है. इस विधि जल्दी सक्रियण घटनाओं का पता लगाने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि वहाँ कोई उपयुक्त व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी है कि अंतर्जात फॉस्फोरीलेच्ड IRF5 का पता लगा सकते हैं. पहले, कई प्रकाशित अध्ययन IRF5 dimerization का आकलन करने के लिए देशी पृष्ठ का इस्तेमाल किया. हालांकि, इन अध्ययनों के बहुमत exogenous epitope-tagged IRF5 के overexpression पर निर्भर सक्रियण स्थितिकाविश्लेषण करने के लिए 2 ,13,24,36,37 . यह काम एक मानव प्लाज्मा cytoid डेन्ड्रिटिक सेल (pDC) लाइन में एक संशोधित देशी पेज तकनीक के माध्यम से अंतर्जात IRF5 dimerization का विश्लेषण करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जहां IRF5 गतिविधि अपने समारोह के लिए महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है1, 38,39,40. इसी तकनीक को अन्य कोशिका रेखाओं23पर लागू किया गया है।
प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित एक संशोधित देशी पृष्ठ है कि अंतर्जात IRF5 के दोनों monomeric और dimeric रूपों भेद है. कुछ अध्ययन ों में विशेष इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री तकनीक23,27,28,30</…
The authors have nothing to disclose.
काम Croucher फाउंडेशन और सिटी विश्वविद्यालय स्टार्टअप फंड से धन द्वारा समर्थित किया गया था. हम प्रयोग और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के साथ मदद के लिए चाउ प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद.
2-Mercaptoethanol | Life Technologies, HK | 21985023 | |
300 W/250 V power supply 230 V AC | Life Technologies, HK | PS0301 | |
Anti-IRF5 antibody | Bethyl Laboratories, USA | A303-385 | |
BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) | EcoLife, HK | MR-12 | |
EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4 X 100 mL | Life Technologies | 15575020 | |
Glycerol 500 mL | Life Technologies | 15514011 | |
Glycine | Life Technologies, HK | 15527013 | |
Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 610-145-002-0.5 | |
Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 611-145-002-0.5 | |
Halt protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, HK | 78430 | |
HEPES | Life Technologies, HK | 15630080 | |
LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Gene Company, HK | 927-50000 | |
Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories | Life Technologies, HK | NW2000 | |
NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit | Life Technologies, HK | BN1001BOX | |
NativePAGE Running Buffer 20x | Life Technologies, HK | BN2001 | |
NativePAGE Sample Buffer 4x | Life Technologies, HK | BN2003 | |
NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol | Tin Hang/Calbiochem, HK | #492016-100ML | |
PBS 7.4 | Life Technologies, HK | 10010023 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Bio-gene/Merck Millipore, HK | IPFL00010 | |
Protein assay kit II (BSA) | Bio-Rad, HK | 5000002 | |
R848 | Invivogen, HK | tlrl-r848 | |
RPMI 1640 | Life Technologies, HK | 61870127 | |
Sodium Chloride | ThermoFisher | BP358-1 | |
Sodium deoxycholate ≥97% (titration) | Tin Hang/Sigma, HK | D6750-100G | |
Tris | Life Technologies, HK | 15504020 | |
TWEEN 20 | Tin Hang/Sigma, HK | #P9416-100ML |