הערכה סטריאוולוגית של אורך סיבים Cholinergic בגרעין באסליס של מיינרט של המוח עכבר
Summary
אורך סיבים עצביים בתוך מבנה תלת מימדי של אזור המוח הוא פרמטר אמין כדי לכמת שלמות מבנית נוירואליות ספציפית או ניוון. מאמר זה מפרט שיטת כימות סטריאוולוגית למדידת אורך סיבים cholinergic בתוך הגרעין של מיינרט בעכברים כדוגמה.
Abstract
אורך הcholinergic או מגוון עצבי באזורי מוח שונים מתואמים לעתים קרובות לתפקוד הספציפי של האזור. סטריאולוגיה היא שיטה שימושית לכמת פרופילים עצביים של מבני מוח שונים. כאן אנו מספקים פרוטוקול סטריאולוגי מבוסס תוכנה כדי להעריך את האורך הכולל של סיבי cholinergic בגרעין באסליס של מיינרט (NBM) של המוח הקדמי הבסיס. השיטה משתמשת בחללית כדור חלל עבור הערכות אורך. הסיבים cholinergic הם דמיינו על ידי כולין acetyltransferase (צ’אט) חיסוני עם החזרת peroxidase-diaminobenzidine (מערכת האיתור ההרפ). פרוטוקול הצביעת תקף גם עבור שערוך מספר סיבים ותאים באזורי מוח שונים באמצעות תוכנת סטריאולוגיה. פרוטוקול סטריאולוגיה יכול לשמש להערכת כל הפרופילים הליניריים כגון סיבי האמנואיטיב, סיבים דואמיאנרגיות/catecholaminergic, סיבים מואריגיים, תהליכים אסטוניים, או אפילו פרופילי כלי דם.
Introduction
אומדנים כמותיים של אורך ו/או צפיפות סיבי עצב במוח הם פרמטרים חשובים של מחקרים נוירופתולוגיים. אורך הcholinergic, הדוגיים והאקסזיות באזורי מוח שונים מתואמים לעתים קרובות לפונקציות הספציפיות של האזור. מכיוון שהפצת אקסונים אלה הוא בדרך כלל הטרוגנית, עיצוב מבוסס סטריאולוגיה משמש כדי למנוע הטיה במהלך הדגימה. בדיקת כדור החלל של סטריאולוגיה תוכננה לספק מדדים יעילים ואמינים של מבנים כמו שורה כגון סיבים עצביים באזור של עניין1. הבדיקה עושה כדור וירטואלי כי הוא מוטל בשיטתיות ברקמה כדי למדוד צמתים קו עם פני השטח של הגשוש. מכיוון שאי אפשר לשים בדיקות כדור ברקמה לניתוח, התוכנה הזמינה מסחרית מספקת כדור תלת-מימדי וירטואלי (3D), שהוא בעצם סדרה של עיגולים קונצנטריים של קטרים שונים המייצגים את פני השטח של לווין הספירה.
נוירוניוון cholinergic סלקטיבי הוא אחד המאפיינים העקביים של מחלת אלצהיימר (AD)2,3,4. שידור cholinergic לקוי נחשב לגורם סיבתי לירידה קוגניטיבית ב-AD. חוסר תפקוד Cholinergic ניכר גם בהפרעות נפשיות רבות אחרות כגון פרקינסון, התמכרות, סכיזופרניה. היבטים שונים של cholinergic נוירוניוון הם לומדים בדגמי בעלי חיים (g., הפחתת אצטילכולין5, שיחה חלבון6, cholinergic סיבים נוירוניוון בקרבת שלטי עמילואיד6, ולהקטין את cholinergic סיבים ו הסינפטיות הסינפטית7,8). ניוון סיבים הוא האמין להתרחש מוקדם יותר מאשר אובדן עצבי, כי cholinergic הפסד עצבי לא תמיד נצפתה במחקרים. רוב הנוירונים הcholinergic הם במוח הקדמי הבסיס ואת גזע המוח, ואת הפרויקט אקסונים שלהם אזורי המוח שונים כגון מערבולות וההיפוקמפוס. NBM ממוקם המוח הקדמי הבסיס והוא נמצא אחד מאזורי המוח המושפעים בדרך כלל ב-AD.
שיטת השבר של סטריאולוגיה מבוססת על דגימה אקראית שיטתית של רקמה ברמות מרובות. שבר דגימת מקטע (SSF) הוא דגימה שיטתית של מקטעים שאינם מבוססי מחשב עבור שיטת השבר של סטריאולוגיה. שבר בדגימת שטח (ASF) הוא משבר של אזור באזור העניין במקטע. שבר בדגימת עובי (TSF) הוא השבר של עובי המקטע. בדיקת כדור החלל מאפשרת לנו לכמת פרופילים של עניין בתחום תלת-ממדי במקומות שעברו שבירה. כאן אנו משתמשים כדור חלל בדיקה להערכת האורך הכולל של סיבי cholinergic ב NBM של המוח העכבר כדי להמחיש את ההליכים. הפרוטוקול הנוכחי מספק פרטים על עיבוד רקמות, שיטות דגימה עבור סטריאולוגיה, מכתים אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדן צ’אט, סטריאולוגיה משוחדת להערכת אורך סיבים cholinergic וצפיפות סיבים ב NBM של המוח העכבר.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו להדגים שיטה כדי להעריך את הצפיפות של סיבים cholinergic ב NBM באמצעות כדור החלל (ספירה) בדיקה. בדיקה זו מעריכה את אורך הסיבים הכולל באזור הריבית. האורך הכולל יכול להיות מחולק על ידי נפח של האזור כדי לקבל את צפיפות סיבים. כדי להעריך את עוצמת הקול של האזור, נעשה שימוש בפעולת השירות count של נקודות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים W.Z.S. ממחקר ופיתוח רפואי שירות, המחלקה לעניינים ותיקי (הצטיינות סקירה 1I01 BX001067-01A2), האגודה לאלצהיימר (NPSPAD-11-202149), ומשאבים מן המערב הביו רפואי . קרן המחקר
Materials
| ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
| Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
| Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
References
- Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. Stereological length estimation using spherical probes. Journal of Microscopy. 206, 54-64 (2002).
- Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis. Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).
- Davies, P., Maloney, A. J. Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer’s disease. The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).
- Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science. 217 (4558), 408-414 (1982).
- Savonenko, A. Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer’s disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities. Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).
- Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse. Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).
- Stokin, G. B. Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).
- He, M. GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability. Scientific Reports. 6, 26116 (2016).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Mouton, P. R. . Unbiased Stereology-A Concise Guide. , (2011).
- West, M. J. Getting started in stereology. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).
- West, M. J. Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).
- Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice. Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).
- Gutierrez-Jimenez, E. Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer’s disease. Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology–reconsidered. Journal of Microscopy. 193, 199-211 (1999).
- Zhang, Y. Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer’s disease. Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).
- McNeal, D. W. Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury. Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).
- Liu, Y. Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 23 (2), 271-279 (2011).
- Gagnon, D. Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys. Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).
- Boncristiano, S. Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).
