Estimación estereológica de la longitud de la fibra colinérgica en el núcleo basalis de Meynert del cerebro del ratón
Summary
La longitud de la fibra neuronal dentro de una estructura tridimensional de una región cerebral es un parámetro confiable para cuantificar la integridad estructural neuronal específica o la degeneración. Este artículo detalla un método de cuantificación estereológica para medir la longitud de la fibra colinérgica dentro del núcleo basalis de Meynert en ratones como ejemplo.
Abstract
La longitud de los axónicos colinérgicos u otros axónicos neuronales en varias regiones cerebrales a menudo se correlacionan con la función específica de la región. La estereología es un método útil para cuantificar los perfiles neuronales de varias estructuras cerebrales. Aquí proporcionamos un protocolo de estereología basado en software para estimar la longitud total de las fibras colinérgicas en el núcleo basalis de Meynert (NBM) del antebrazo basal. El método utiliza una sonda de bola espacial para estimaciones de longitud. Las fibras colinérgicas se visualizan mediante la colina acetiltransferasa (ChAT) inmunomanchado con el líquido rábano peroxidasa-diaminobenzidina (HRP-DAB) sistema de detección. El protocolo de tinción también es válido para la estimación de fibra y número de célula en varias regiones cerebrales utilizando software de estereología. El protocolo de estereología se puede utilizar para la estimación de cualquier perfil lineal como fibras colinoceptivas, fibras dopaminérgicas/catecolaminas, fibras serotonérgicas, procesos de astrocitos o incluso perfiles vasculares.
Introduction
Las estimaciones cuantitativas de longitud y/o densidad de las fibras nerviosas en el cerebro son parámetros importantes de los estudios neuropatológicos. La longitud de los axónicos colinérgicos, dopaminérgicos y serotonérgicos en varias regiones cerebrales a menudo se correlacionan con las funciones específicas de la región. Debido a que la distribución de estos axones es generalmente heterogénea, la estereología basada en el diseño se utiliza para evitar sesgos durante el muestreo. La sonda de bola espacial de estereología ha sido diseñada para proporcionar medidas eficientes y confiables de estructuras similares a líneas como fibras neuronales en una región de interés1. La sonda hace una esfera virtual que se impone sistemáticamente en el tejido para medir las intersecciones de línea con la superficie de la sonda. Debido a que es imposible poner sondas de esfera en el tejido para su análisis, el software disponible comercialmente proporciona una esfera tridimensional virtual (3D), que es básicamente una serie de círculos concéntricos de varios diámetros que representan la superficie de la sonda de esfera.
La neurodegeneración colinérgica selectiva es una de las características consistentes de la enfermedad de Alzheimer (AD)2,3,4. Transmisión colinérgica disfuncional se considera un factor causal para el deterioro cognitivo en AD. Disfunción colinérgica también es evidente en muchos otros trastornos mentales como el Parkinson, adicción, y la esquizofrenia. Diferentes aspectos de la neurodegeneración colinérgica se estudian en modelos animales (por ejemplo, reducción en la acetilcolina5, proteína ChAT6, neurodegeneración de fibra colinérgica en las proximidades de las placas amiloideas6,y disminución de fibras colinérgicas y varicosidades sinápticas7,8). Se cree que la degeneración de la fibra tiene lugar antes que la pérdida neuronal, porque la pérdida neuronal colinérgica no siempre se observa en los estudios. La mayoría de las neuronas colinérgicas están en el antecebrano basal y el tallo cerebral, y sus axones se proyectan a varias regiones cerebrales como los cortices y el hipocampo. NBM está situado en el antecebra basal y se encuentra como una de las áreas cerebrales comúnmente afectadas en AD.
El método fraccionador de estereología se basa en el muestreo aleatorio sistemático de un tejido en múltiples niveles. La fracción de muestreo de sección (SSF) es el muestreo sistemático no basado en computadora de secciones para el método de estereología fraccionador. La fracción de muestreo de área (ASF) es el fraccionamiento de un área de la región de interés en la sección. Fracción de muestreo de espesor (TSF) es el fraccionamiento del espesor de una sección. La sonda de bola espacial nos permite cuantificar perfiles de interés en una esfera 3D en ubicaciones fraccionadas. Aquí utilizamos una sonda de bola espacial para estimar la longitud total de las fibras colinérgicas en el NBM del cerebro del ratón para ilustrar los procedimientos. El protocolo actual proporciona detalles sobre el procesamiento de tejidos, métodos de muestreo para la estereología, tinción inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo ChAT y estereología imparcial para estimar la longitud de la fibra colinérgica y la densidad de fibra en el NBM del cerebro del ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí demostramos un método para estimar la densidad de fibras colinérgicas en el NBM utilizando una sonda de bola espacial (esfera). Esta sonda estima la longitud total de la fibra en la región de interés. La longitud total se puede dividir por el volumen de la región para obtener la densidad de fibra. Para estimar el volumen de la región, se utilizó el método de recuento de puntos Cavalieri. El método de recuento de puntos Cavalieri es un estimador imparcial y eficiente de un volumen de referencia 3D para cual…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones a W.Z.S. del Servicio de Investigación y Desarrollo Médico, El Departamento de Asuntos de Veteranos (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), la Asociación de Alzheimer (NPSPAD-11-202149), y recursos del Midwest Biomedical Fundación de Investigación.
Materials
| ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
| Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
| Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
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