Stereologische schatting van cholinerge vezel lengte in de kern Basalis van Meynert van de muis hersenen
Summary
Neuronale vezel lengte binnen een driedimensionale structuur van een hersengebied is een betrouwbare parameter om specifieke neuronale structurele integriteit of degeneratie te kwantificeren. Dit artikel beschrijft een stereologische kwantificeringsmethode om cholinerge vezellengte binnen de kernbasisvan Meynert bij muizen als voorbeeld te meten.
Abstract
De lengte van cholinerge of andere neuronale axonen in verschillende hersengebieden zijn vaak gecorreleerd met de specifieke functie van de regio. Stereologie is een nuttige methode om neuronale profielen van verschillende hersenstructuren te kwantificeren. Hier bieden we een software-gebaseerde stereologie protocol om de totale lengte van cholinerge vezels in de kern basalis van Meynert (NBM) van de basale voorhersenen schatten. De methode maakt gebruik van een ruimtesonde voor lengteschattingen. De cholinerge vezels worden gevisualiseerd door choline acetyltransferase (ChAT) immunostaining met de mierikswortel peroxidase-diaminobenzidine (HRP-DAB) detectiesysteem. Het kleuringsprotocol is ook geldig voor vezel- en celnummerschatting in verschillende hersengebieden met behulp van stereologiesoftware. Het stereologieprotocol kan worden gebruikt voor de schatting van lineaire profielen zoals cholinoceptieve vezels, dopaminerge/catecholaminere vezels, serotonergic vezels, astrocyteprocessen of zelfs vasculaire profielen.
Introduction
Kwantitatieve schattingen van lengte en/of dichtheid van zenuwvezels in de hersenen zijn belangrijke parameters van neuropathologische studies. De lengte van cholinerge, dopaminerge, en serotonergic axonen in verschillende hersengebieden zijn vaak gecorreleerd met de specifieke functies van de regio. Omdat de verdeling van deze axonen over het algemeen heterogeen is, wordt op het ontwerp gebaseerde stereologie gebruikt om bias tijdens de bemonstering te voorkomen. De ruimtesonde van stereologie is ontworpen om efficiënte en betrouwbare maatregelen van lijn-achtige structuren zoals neuronale vezels in een regio van belang1. De sonde maakt een virtuele bol die systematisch in het weefsel wordt opgelegd om lijnkruisingen met het oppervlak van de sonde te meten. Omdat het onmogelijk is om bolsondes in het weefsel te plaatsen voor analyse, biedt de commercieel beschikbare software een virtuele driedimensionale (3D) bol, wat in feite een reeks concentrische cirkels is van verschillende diameters die het oppervlak van de bolsonde vertegenwoordigen.
Selectieve cholinerge neurodegeneratie is een van de consistente kenmerken van de ziekte van Alzheimer (AD)2,3,4. Disfunctionele cholinerge transmissie wordt beschouwd als een oorzakelijke factor voor cognitieve achteruitgang in AD. Cholinerge disfunctie is ook duidelijk in vele andere psychische stoornissen zoals Parkinson, verslaving, en schizofrenie. Verschillende aspecten van cholinerge neurodegeneratie worden bestudeerd in diermodellen (bijvoorbeeld, vermindering van acetylcholine5, ChAT eiwit6, cholinerge vezel neurodegeneratie in de buurt van amyloïde plaques6, en afname van cholinerge vezels en synaptische spataderen7,8). Vezeldegeneratie wordt verondersteld plaats te vinden eerder dan neuronale verlies, omdat cholinerge neuronale verlies niet altijd wordt waargenomen in studies. De meeste cholinerge neuronen zijn in de basale voorhersenen en de hersenstam, en hun axonen project naar verschillende hersengebieden zoals de cortices en hippocampus. NBM is gelegen in de basale voorhersenen en bleek een van de meest getroffen hersengebieden in AD.
De fractionatormethode van stereologie is gebaseerd op systematische willekeurige bemonstering van een weefsel op meerdere niveaus. Sectiebemonsteringsfractie (SSF) is de niet-computergebaseerde systematische bemonstering van secties voor de fractionatormethode van stereologie. De zonebemonsteringsfractie (AF) is een breuk van een gebied in de regio van belang in de sectie. Dikte bemonstering sfractie (TSF) is de fractionatie van de dikte van een sectie. De ruimtesonde stelt ons in staat om profielen van belang in een 3D-bol te kwantificeren op gefractioneerde locaties. Hier gebruiken we een ruimtesonde voor de schatting van de totale lengte van cholinerge vezels in de NBM van muishersenen om de procedures te illustreren. Het huidige protocol bevat details over weefselverwerking, bemonsteringsmethoden voor stereologie, immunohistochemische kleuring met behulp van het ChAT-antilichaam en onbevooroordeelde stereologie om cholinerge vezellengte en vezeldichtheid in de NBM van de muishersenen te schatten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier demonstreren we een methode om de dichtheid van cholinerge vezels in de NBM te schatten met behulp van een ruimtebal (bol) sonde. Deze sonde schat de totale vezellengte in het gebied van belang. De totale lengte kan worden gedeeld door het volume van de regio om de vezeldichtheid te krijgen. Om het volume van de regio te schatten, werd de Methode van het puntentellingsaantal Cavalieri gebruikt. De Cavalieri-punttellingsmethode is een onpartijdige en efficiënte schatter van een 3D-referentievolume voor elke regio. D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies aan W.Z.S. van de Medical Research and Development Service, Department of Veterans Affairs (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), de Alzheimer Association (NPSPAD-11-202149), en bronnen uit de Midwest Biomedical Stichting Onderzoek.
Materials
| ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
| Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
| Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
References
- Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. Stereological length estimation using spherical probes. Journal of Microscopy. 206, 54-64 (2002).
- Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis. Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).
- Davies, P., Maloney, A. J. Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer’s disease. The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).
- Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science. 217 (4558), 408-414 (1982).
- Savonenko, A. Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer’s disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities. Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).
- Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse. Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).
- Stokin, G. B. Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).
- He, M. GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability. Scientific Reports. 6, 26116 (2016).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Mouton, P. R. . Unbiased Stereology-A Concise Guide. , (2011).
- West, M. J. Getting started in stereology. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).
- West, M. J. Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).
- Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice. Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).
- Gutierrez-Jimenez, E. Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer’s disease. Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology–reconsidered. Journal of Microscopy. 193, 199-211 (1999).
- Zhang, Y. Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer’s disease. Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).
- McNeal, D. W. Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury. Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).
- Liu, Y. Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 23 (2), 271-279 (2011).
- Gagnon, D. Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys. Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).
- Boncristiano, S. Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).
