قياس اثار البكتيريا والمواد الكيميائية علي نفاذيه المعوية من اليجان
Summary
يصف هذا البروتوكول كيفيه قياس نفاذيه المعوية من الايلي+آت Caenorhabditis. هذا الأسلوب مفيد للبحوث البيولوجية الاساسيه علي الصحة المعوية المتعلقة بالتفاعل بين البكتيريا المعوية والمضيفة وللكشف لتحديد عوامل بروبيوتيك والكيميائية لعلاج متلازمة الأمعاء المتسربة وامراض الأمعاء التهابيه.
Abstract
في الكائنات الحية ، فرط نفاذيه الأمعاء هو أحد الاعراض الخطيرة التي تؤدي إلى العديد من امراض الأمعاء التهابيه (IBDs). Caenorhabditis ايليتس هو نموذج الحيوانية غير الثدييات التي تستخدم علي نطاق واسع كنظام الفحص بسبب عمرها القصير ، والشفافية ، والفعالية من حيث التكلفة ، وعدم وجود قضايا الأخلاق الحيوانية. في هذه الدراسة, تم تطوير طريقه للتحقيق في اثار البكتيريا المختلفة و 3, 3 ‘-دييندوليلميميثان (خافت) علي نفاذيه الأمعاء من c. اليجانينات مع نظام تحليل الصور عاليه الانتاجيه. كانت الديدان مصابه ببكتيريا الأمعاء المختلفة أو cotreated مع DIM ل 48 h وتتغذي مع فلوريسئين ايزوثيسيانات (FITC)-ديكدكان بين عشيه وضحيها. ثم ، تم فحص نفاذيه الأمعاء عن طريق مقارنه الصور مضان وكثافة مضان داخل الهيئات دوده. قد يكون هذا الأسلوب أيضا القدرة علي تحديد بروبيوتيك والبكتيريا المعوية المسببة للامراض التي تؤثر علي نفاذيه الأمعاء في نموذج الحيوانية وفعاله لدراسة اثار المواد الكيميائية الضارة أو تعزيز الصحة علي نفاذيه الأمعاء والصحة المعوية. ومع ذلك ، فان هذا البروتوكول لديه أيضا بعض القيود الكبيرة علي المستوي الجيني ، وخاصه لتحديد الجينات التي يتم تغييرها للسيطرة علي المرض ، لان هذا الأسلوب يستخدم في الغالب لتحديد النمط الظاهري. الاضافه إلى ذلك ، يقتصر هذا الأسلوب لتحديد بالبالضبط اي المواد المسببة للامراض تسبب التهاب أو زيادة نفاذيه الأمعاء الديدان اثناء العدوى. ولذلك ، هناك حاجه إلى مزيد من الدراسات المتعمقة ، بما في ذلك التحقيق في اليه الوراثية الجزيئية باستخدام البكتيريا المتحولة والديدان الخيطية ، فضلا عن تحليل المكونات الكيميائية للبكتيريا ، لتقييم كامل وظيفة البكتيريا والمواد الكيميائية في تحديد نفاذيه الأمعاء.
Introduction
تعتبر نفاذيه الأمعاء واحده من الحواجز الرئيسية المتعلقة بالجراثيم المعوية والمناعة المخاطية ومن المرجح ان تتاثر بعوامل عديده ، مثل تعديلات الأمعاء الدقيقة ، والضعف الظهاريه ، أو تعديلات طبقه المخاط1. وقد أفادت الصحف الاخيره بروتوكولات فعاله لقياس نفاذيه الأمعاء من خلايا الأمعاء البشرية مثقف من خلال تحليل معدلات الجريان الفلورية عبر طبقه الخلايا المعوية2، ولكن عدد اقل من الأوراق البحثية تقديم اجراء مناسب لقياس نفاذيه الأمعاء في الديدان الخيطية ، وخاصه في c. اليجنيديس.
هناك نوعان من البروتوكولات التمثيلية لقياس نفاذيه الأمعاء في c. اليجليفس باستخدام النيل الأحمر3 والصوديوم ايرغلولوسين (أو فحص الحوت)4,5. في هذا البروتوكول ، استخدمنا FITC-ديدكغان (متوسط الوزن الجزيئي 10,000) ، الذي لديه وزن جزيئي اعلي بكثير من النيل الأحمر (MW = 318.37) والصوديوم الثنائي (MW = 792.85). FITC-ديدكغان هو أكثر تشابها من النيل الأحمر أو الاصباغ الصوديوم الثنائية إلى المغذيات الجزيئات الفعلية مثل الكربوهيدرات ، والتي يتم امتصاصها من خلال طبقه الأمعاء. نفاذيه المعوية من c. التي تغذيها الصوديوم erioglaucine (الأزرق الحوت صبغ) يمكن تقييمها بسهوله دون المجهر مضان. ومع ذلك ، في فحص الحوت ، والتحليل الكمي من نفاذيه الأمعاء من الصعب بسبب عدم وجود توحيد وينبغي تقييم يدويا4،5. في حاله الفحص الأحمر النيلي ، بقع النيل الحمراء أيضا قطرات الدهون في الخلايا ، والتي قد تتداخل مع التحديد الدقيق لنفاذيه الأمعاء في c. ايلينز6. تتيح البروتوكولات الحالية تحليلا كميا سريعا ودقيقا لنفاذيه الأمعاء في العلاج بالبكتيريا المعوية المختلفة والمواد الكيميائية مع تجنب تلطيخ الدهون بشكل غير محدد.
C. اليجايليس هو نموذج نموذجي في المجالات البيولوجية نظرا لسعره في المتناول ، والتلاعب سهله ، وقضايا الأخلاق الحيوانية محدوده ، وعمر قصير ، وهو أمر مفيد للتجارب السريعة7. وعلي وجه الخصوص ، بعد نشر الجينوم بأكمله ، تم العثور علي ما يقرب من 40 في المائة من الجينات الموجودة في المجين البشري بالجينات التي تسبب الامراض التي تصيب الإنسان8. وعلاوة علي ذلك ، فان هيئه شفافة تسمح المراقبة داخل الكائن الحي ، وهو أمر مفيد للبحث عن الاحداث الخلوية والتطبيقات الفلورية في بيولوجيا الخلية ، علي سبيل المثال ، تلطيخ الخلايا الجذعية مع DAPI أو مناعي9. C. وغالبا ما يستخدم اليجان كالحيوانية التجريبية لدراسة التفاعل بين الجراثيم الأمعاء والمضيف; الاضافه إلى ذلك ، يستخدم c. اليجراns لشاشه الصحة المعززة بروبيوتيك البكتيريا10،11،12 فضلا عنالمواد الكيميائية الغذائية تعزيزالصحة المعوية 13 ،14.
الزائفة الزنجاريه والمكورات المعوية البرازيه هي بكتيريا الأمعاء المعروفة التي تؤثر سلبا علي نظام الجهاز الهضمي ، وخاصه الخلايا الظهاريه قولون من الأمعاء15،16. ولذلك ، فان قياس نفاذيه الأمعاء الناجمة عن هذه البكتيريا ضروري لفحص وتطوير الادويه الجديدة التي يمكن ان تستعيد وتقلل من الضرر الناجم عن التهاب البكتيري والعدوى. في هذا البروتوكول ، اختبرنا اثار هذه البكتيريا المعوية علي نفاذيه الأمعاء من c. اليجايليس.
ونحن أيضا الإبلاغ عن بروتوكول الأمثل لاختبار المواد الكيميائية علي نفاذيه الأمعاء من c. اليجليس. لهذا الغرض ، استخدمنا 3 ، 3 ‘-دييندوليلميميثان (خافت) كنموذج الكيميائية لان خافت هو مركب المستقلب النشطة بيولوجيا المستمدة من indole-3-carbinol ، والتي هي موجودة في النباتات الغذائية براسيكا ، وقد أفيد ان لها اثار علاجيه علي ibd في الفئران17،18. الاضافه إلى ذلك ، اكتشفنا مؤخرا ان خافت يحسن الخلل الوظيفي نفاذيه الأمعاء في كل من خلايا الأمعاء البشرية مثقف ، فضلا عن نموذج الديدان الخيطية c. اليجايليس19.
في هذه الدراسة ، استخدمنا ثلاثه ظروف تجريبية مختلفه. أولا ، قمنا بقياس اثار البكتيريا المختلفة ، p. الزنجاريه و e. faecalis ، علي نفاذيه الأمعاء (الشكل 1). ثانيا ، قمنا بقياس تاثيرات الزنجاريه الحية والحرارية علي نفاذيه الأمعاء (الشكل 2). ثالثا ، قمنا بقياس اثار DIM (نموذج الكيميائية) علي نفاذيه المعوية من c. اليجان الفيدرالية مع الزنجاريه (الشكل 3).
وكان الهدف من هذه الدراسة لتطوير البروتوكولات الأمثل التي تقيس نفاذيه الأمعاء من c. اليجليس، والتي يتم تغييرها عن طريق العلاج مع البكتيريا المعوية المختلفة وكذلك مع المواد الكيميائية.
Protocol
Representative Results
Discussion
من خلال استخدام هذه الطريقة الجديدة لتحديد نفاذيه الأمعاء في c. اليجايليس ، والذي يجمع بين المجهر الألى المجهري وتحليل الصورة الكمية ، والاختلافات الناجمة عن الكائنات المجهرية المعوية أو المواد الكيميائية يمكن تحديدها في الجسم المجري ، وتحديدا في الأمعاء c. . هذا البروتوكول مفيد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظيت هذه الدراسة بدعم معهد كوريا للبحوث العلمية والتكنولوجية (2E29563).
Materials
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate – dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
References
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).
- Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers. The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).
- Ren, M., et al. Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide. Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).
- Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
- Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).
- Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining. Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).
- Johnson, T. E. Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research. Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).
- Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).
- Hubbard, E. J. A. Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology. Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Park, M. R., et al. Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor. Scientific Reports. 8, 7441 (2018).
- Kim, Y., Mylonakis, E. Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses. Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Dinh, J., et al. Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1. PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).
- Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans. Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).
- Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA. Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).
- Laughlin, R. S., et al. The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis. Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).
- Huang, Z., et al. 3,3′-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway. Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).
- Jeon, E. J., et al. Effect of Oral Administration of 3,3′-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).
- Kim, J. Y., et al. 3,3′-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).
- Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Al Atya, A. K., et al. Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium. Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).
- Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update. Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).
- Pollack, M. The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity. Reviews of Infectious Diseases. 5, 979-984 (1983).
- Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).
- Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro. Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).
- Kirikae, T., et al. Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).
- Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication. Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).
- Kim, Y. H., et al. 3,3′-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).
- Kanmani, P., et al. Probiotics and its functionally valuable products-a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).
- Nguyen, M. T., Gotz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).
