Medición de los efectos de las bacterias y los productos químicos en la permeabilidad intestinal de los ceganes
Summary
Este protocolo describe cómo medir la permeabilidad intestinal de Caenorhabditis elegans. Este método es útil para la investigación biológica básica sobre la salud intestinal relacionada con la interacción entre las bacterias intestinales y su huésped y para la detección para identificar agentes probióticos y químicos para curar el síndrome del intestino con fugas y enfermedades inflamatorias intestinales.
Abstract
En los organismos vivos, la hiperpermeabilidad intestinal es un síntoma grave que conduce a muchas enfermedades inflamatorias intestinales (EII). Caenorhabditis elegans es un modelo animal no mamífero que es ampliamente utilizado como un sistema de ensayo debido a su corta vida útil, transparencia, rentabilidad y falta de problemas de ética animal. En este estudio, se desarrolló un método para investigar los efectos de diferentes bacterias y 3,3′-diindolylmethane (DIM) en la permeabilidad intestinal de C. elegans con un sistema de análisis de imagen de alto rendimiento. Los gusanos fueron infectados con diferentes bacterias intestinales o cotratados con DIM durante 48 h y alimentados con isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextran durante la noche. Luego, se examinó la permeabilidad intestinal comparando las imágenes de fluorescencia y la intensidad de la fluorescencia dentro de los cuerpos de gusanos. Este método también puede tener el potencial de identificar bacterias intestinales probióticas y patógenas que afectan la permeabilidad intestinal en el modelo animal y es eficaz para examinar los efectos de los productos químicos nocivos o que promueven la salud en la permeabilidad intestinal y la salud intestinal. Sin embargo, este protocolo también tiene algunas limitaciones considerables a nivel genético, especialmente para determinar qué genes se alteran para controlar la enfermedad, ya que este método se utiliza principalmente para la determinación fenotípica. Además, este método se limita a determinar exactamente qué sustratos patógenos causan inflamación o aumentan la permeabilidad de los intestinos de los gusanos durante la infección. Por lo tanto, se requieren más estudios en profundidad, incluida la investigación del mecanismo genético molecular utilizando bacterias y nematodos mutantes, así como el análisis de componentes químicos de bacterias, para evaluar completamente la función de las bacterias y los productos químicos para determinar la permeabilidad intestinal.
Introduction
La permeabilidad intestinal se considera como una de las principales barreras relacionadas con la microbiota intestinal y la inmunidad a la mucosa y es probable que se vea afectada por varios factores, como modificaciones de la microbiota intestinal, deterioro epitelial o alteraciones de la capa de moco1. Documentos recientes han reportado protocolos eficaces para medir la permeabilidad intestinal de las células intestinales humanas cultivadas mediante el análisis de las tasas de flujo de fluorescencia a través de la capa de células intestinales2, pero menos documentos de investigación presentan un procedimiento adecuado para medir la permeabilidad intestinal en los nematodos, particularmente en C. elegans,mediante el uso de la tinción FITC-dextran.
Existen dos protocolos representativos para medir la permeabilidad intestinal en C. elegans utilizando Rojo nilo3 y erioglaucina disódico (o el ensayo Pitufo)4,5. En este protocolo, utilizamos FITC-dextran (peso molecular medio 10.000), que tiene un peso molecular mucho mayor que el rojo del Nilo (MW 318,37) y el erioglaucina disódico (MW a 792,85). FITC-dextran es más similar a los colorantes disódicos rojos del Nilo o erioglaucina a nutrientes macromoleculares reales como los carbohidratos, que se absorben a través de la capa intestinal. La permeabilidad intestinal de C. elegans alimentados con erioglaucina disódico (tinte azul pitufo) se puede evaluar fácilmente sin microscopía de fluorescencia. Sin embargo, en el ensayo Pitufo, el análisis cuantitativo de la permeabilidad intestinal es difícil debido a la falta de estandarización y debe evaluarse manualmente4,5. En el caso del ensayo rojo del Nilo, el rojo del Nilo también tiñe las gotas de lípidos en las células, lo que puede interferir con la determinación exacta de la permeabilidad intestinal en C. elegans6. Los protocolos actuales permiten un análisis cuantitativo rápido y preciso de la permeabilidad intestinal en C. elegans tratados con diversas bacterias intestinales y productos químicos evitando la tinción de lípidos inespecíficos.
C. elegans es un modelo típico en campos biológicos debido a su precio asequible, fácil manipulación, problemas de ética animal limitada, y corta vida útil, que es beneficioso para la experimentación rápida7. En particular, después de que se publicó todo el genoma de C. elegans, casi el 40% de los genes en el genoma de C. elegans fueron encontrados como ortologos a los genes que causan enfermedades humanas8. Además, el cuerpo transparente permite la observación dentro del organismo, lo que es ventajoso para la investigación de eventos celulares y para aplicaciones de fluorescencia en biología celular, por ejemplo, la tinción de células madre con DAPI o inmunohistoquímica9. C. elegans se utiliza a menudo como un animal experimental para estudiar la interacción entre la microbiota intestinal y el huésped; además, C. elegans se utiliza para la pantalla de bacterias probióticas que promueven la salud10,11,12, así como productos químicos dietéticos que promueven la salud intestinal13,14.
Pseudomonas aeruginosa y Enterococcus faecalis son bacterias intestinales bien conocidas que afectan negativamente el sistema gastrointestinal, especialmente las células epiteliales colónicas del tracto intestinal15,16. Por lo tanto, medir la permeabilidad intestinal desencadenada por estas bacterias es necesario para el cribado y desarrollo de nuevos fármacos que pueden recuperar y reducir el daño causado por la inflamación bacteriana y la infección. En este protocolo, probamos los efectos de estas bacterias intestinales en la permeabilidad intestinal de C. elegans.
También informamos de un protocolo optimizado para probar productos químicos sobre la permeabilidad intestinal de C. elegans. Para este propósito, utilizamos 3,3′-diindolylmethane (DIM) como un modelo químico porque DIM es un compuesto metabolito bioactivo derivado de indol-3-carbinol, que está presente en las plantas de alimentos Brassica, y se ha informado que tiene efectos terapéuticos sobre la EII en ratones17,18. Además, recientemente descubrimos que DIM mejora la disfunción de la permeabilidad intestinal tanto en las células intestinales humanas cultivadas como en el nematodo modelo C. elegans19.
En este estudio, utilizamos tres condiciones experimentales diferentes. En primer lugar, medimos los efectos de las diferentes bacterias, P. aeruginosa y E. faecalis, en la permeabilidad intestinal(Figura 1). En segundo lugar, medimos los efectos de P. aeruginosa en la permeabilidad intestinal(Figura 2). En tercer lugar, medimos los efectos de DIM (un modelo químico) en la permeabilidad intestinal de C. elegans alimentados con P. aeruginosa (Figura 3).
El objetivo de este estudio fue desarrollar protocolos optimizados que midan la permeabilidad intestinal de C. elegans,que se cambia por el tratamiento con diversas bacterias intestinales, así como con productos químicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mediante la utilización de este nuevo método para determinar la permeabilidad intestinal en C. elegans, que combina la microscopía de fluorescencia automatizada y el análisis cuantitativo de imágenes, las diferencias causadas por microorganismos intestinales o productos químicos se pueden determinar in vivo, específicamente en el intestino de C. elegans. Este protocolo es útil para las investigaciones de permeabilidad intestinal y aplicable a muchas tareas, como la determinación reactiva de esp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por una beca de investigación intramuros del Instituto de Ciencia y Tecnología de Corea (2E29563).
Materials
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate – dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
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