케노하브디티스 예쁜꼬마선충의 장 내 침투성에 대한 박테리아와 화학물질의 영향 측정
Summary
이 프로토콜은 예쁜꼬마선충의장 투과성을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 장 내 박테리아와 숙주 간의 상호 작용과 관련된 장 건강에 대한 기본 생물학적 연구와 새는 장 증후군 및 염증성 장 질환을 치료하는 프로바이오틱 및 화학 약제 식별 스크리닝에 유용합니다.
Abstract
살아있는 유기체에서 장 과다 투과성은 많은 염증성 장 질환 (IBDs)으로 이어지는 심각한 증상입니다. Caenorhabditis 예쁜꼬마선충은 짧은 수명, 투명성, 비용 효율성 및 동물 윤리 문제의 부족으로 인해 분석 시스템으로 널리 사용되는 비 포유류 동물 모델입니다. 이 연구에서는, 높은 처리량의 심상 분석 시스템을 가진 C. 예쁜꼬마선충의 장 투과성에 다른 박테리아 및 3,3′-diindolylmethane (DIM)의 효력을 조사하기 위하여 개발된 방법. 벌레는 다른 창자 박테리아에 감염되거나 48 시간 동안 DIM으로 공동 처리되었고 플루오레세인 이소티오차네이트 (FITC)-덱스렌을 하룻밤 동안 공급하였다. 이어서, 장 투과성은 웜 체 내부의 형광 이미지와 형광 강도를 비교하여 조사되었다. 이 방법은 또한 동물 모델에서 장 침투성에 영향을 미치는 probiotic 및 병원 성 장 내 박테리아를 식별 하는 잠재력을 가질 수 있습니다 및 장 투과성 및 장 건강에 유해 하거나 건강 증진 화학 물질의 효과 검사에 대 한 효과적. 그러나, 이 프로토콜은 또한 유전 수준에 있는 몇몇 상당한 제한이 있습니다, 특히 이 방법은 주로 현상형 결정에 사용되기 때문에, 질병을 통제하기 위하여 변경되는 유전자를 결정하기위한. 또한,이 방법은 감염 시 염증을 일으키거나 벌레의 침투성을 증가시키는 병원성 기질이 정확히 무엇인지 결정하는 데 국한됩니다. 따라서, 박테리아의 화학 성분 분석 뿐만 아니라 돌연변이 박테리아와 선충을 이용한 분자 유전 적 메커니즘의 조사를 포함하여 추가심도 연구가 필요하며, 장 투과성을 결정하는 박테리아와 화학 물질의 기능을 완전히 평가할 필요가 있다.
Introduction
장 투과성은 장내 미생물 및 점막 면역과 관련된 주요 장벽 중 하나로 간주되며 장내 미생물 변형, 상피 손상 또는 점액 층 변경과 같은 여러 요인에 의해 영향을 받을 가능성이1. 최근 논문은 장 세포 층2에걸쳐 형광 플럭스 비율을 분석하여 배양 인간 장의 장 투과성을 측정하는 효과적인 프로토콜을보고, 하지만 적은 연구 논문은 선충에서 창자 투과도를 측정하기위한 적절한 절차를 제시, 특히 C. elegans에서,FITC-dextran 염색을 사용하여.
나일 레드3 및 에리오글라우신 디소듐(또는 스머프 분석)을 사용하여 C. 예쁜꼬마선충의 장 투과성을 측정하기 위한 두 가지 대표적인 프로토콜이있다 4,5. 이 프로토콜에서는 나일 레드(MW = 318.37) 및 에리오글라우신 디소듐(MW = 792.85)보다 훨씬 높은 분자량을 가지는 FITC-dextran(평균 분자량 10,000)을 사용했습니다. FITC-dextran은 나일 강색 또는 에리오글라우신 디소듐 염료보다 장층을 통해 흡수되는 탄수화물과 같은 실제 다량 분자 영양소와 더 유사합니다. 에리오글라우신 디소듐(blue Smurf 염료)을 공급받은 C. 예쁜꼬마선충의 장 투과성은 형광 현미경 검사법 없이 쉽게 평가할 수 있습니다. 그러나, 스머프 분석법에서는, 장 투과성의 정량적 분석은 표준화의 부족으로 인해 어렵고 수동으로 평가되어야한다4,5. 나일 붉은 분석의 경우, 나일 레드는 또한 C. elegans6에서창자 투과성의 정확한 결정을 방해할 수 있는 세포에 있는 지질 방울을 얼룩지게 합니다. 본 프로토콜은 비특이적 지질 염색을 피하면서 다양한 장내 세균및 화학물질로 처리된 C. elegans의 장 투과성의 신속하고 정확한 정량적 분석을 가능하게 합니다.
C. 예쁜꼬마선충은 저렴한 가격, 쉬운 조작, 제한된 동물 윤리 문제 및 짧은 수명으로 인해 생물학적 분야에서 전형적인 모델로, 빠른 실험에 도움이 되는7. 특히, 전체 C. elegans 게놈이 발표된 후, C. elegans 게놈에 있는 유전자의 거의 40%는 인간 질병을 일으키는 원인이 되는 유전자에 정형고인 것으로 나타났습니다8. 더욱이, 투명한 체체는 세포 체내 관찰을 가능하게 하며, 이는 세포 체적 사건을 연구하고 세포 생물학에서 형광 적용, 예를 들어, DAPI 또는 면역 조직화학으로 염색하는 줄기 세포 에 유리하다9. C. 예쁜꼬마선충은 종종 장내 미생물과 숙주 간의 상호작용을 연구하기 위해 실험동물로 사용된다. 또한, C. elegans는 장건강을증진시키는 식이 화학물질뿐만 아니라 건강 증진 프로바이오틱박테리아10,11,12를 선별하는데 사용된다.
슈도모나스 녹농균 및 장내 대변은 위장시스템, 특히 장의 대장상피세포(15,16)에부정적인 영향을 미치는 잘 알려진 장내 세균이다. 따라서, 이러한 박테리아에 의해 유발된 장 투과성을 측정하는 것은 세균염증 및 감염으로 인한 손상을 회복및 감소시킬 수 있는 신약의 스크리닝 및 개발에 필요하다. 이 프로토콜에서는 C. elegans의장 투과성에 대한 이러한 장 내 세균의 영향을 테스트했습니다.
우리는 또한 C. elegans의장 투과성에 화학 물질을 테스트하기위한 최적화 된 프로토콜을보고합니다. 이를 위해, 우리는 3,3′-디인돌릴메탄(DIM)을 모델 화학물질로 사용했는데, DIM은 브라시카 식품 식물에 존재하는 인돌-3-카르비놀에서 유래한 생리활성 대사산물 화합물이기 때문에, 마우스17,18에서IBD에 치료 효과가 있는 것으로 보고되었다. 또한, 우리는 최근 DIM이 배양된 인간 장 세포뿐만 아니라 모델 선충 C. elegans19모두에서 장 투과성 기능 장애를 개선한다는 것을 발견했습니다.
이 연구에서는 세 가지 다른 실험 조건을 사용했습니다. 먼저, 우리는 다른 박테리아의 효과를 측정, P. aeruginosa 및 E. 대변, 장 투과성에(그림 1). 둘째, 우리는 장 투과성에 대한 살아있는 및 열 불활성화 P. aeruginosa의 효과를 측정했습니다(그림 2). 셋째, 우리는 Dim (모델 화학 물질)이 P. aeruginosa로 공급된 C. 예쁜꼬마선충의 장 투과성에 미치는 영향을 측정했습니다(그림3).
이 연구의 목적은 화학 물질뿐만 아니라 다양한 장내 박테리아로 치료에 의해 변경되는 C. elegans의장 투과성을 측정하는 최적화 된 프로토콜을 개발하는 것이었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
자동 형광 현미경 및 정량적 이미지 분석을 결합한 C. elegans의 창자 투과성을 결정하는 이 새로운 방법을 활용하여 장내 미생물 이나 화학 물질에 의한 차이를 생체 내에서, 특히 C. elegans 장에서 결정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 장 투과성 조사에 유용하며 편리하고 쉬운 조작으로 인해 스트레스 조건 및 형태 학적 검사에서 반응성 산소 종 (ROS) 측정과 같은 많은 작업에 적용 할 수 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
본 연구는 한국과학기술원 내연구보조금(2E29563)의 지원을 받았다.
Materials
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate – dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
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