Système centrifuge automatisé de contre-flux pour le traitement cellulaire à petite échelle
Summary
L’automatisation est essentielle à la mise à l’échelle et à la gestion des coûts dans la fabrication de cellules. Ce manuscrit décrit l’utilisation d’un dispositif de traitement centrifuge de contre-flux pour automatiser l’échange de tampons et les étapes de concentration cellulaire pour le biotraitement à petite échelle.
Abstract
La commercialisation réussie des thérapies géniques et cellulaires nécessite des procédés de fabrication rentables et évolutifs. L’échange de tampons et la concentration des produits sont des composants essentiels pour la plupart des procédés de fabrication. Cependant, aux premiers stades du développement du produit, ces étapes sont souvent effectuées manuellement. La centrifugation manuelle sans issue pour l’échange de tampons est laborieuse, coûteuse et non évolutive. Un système automatisé fermé peut effectivement éliminer cette étape laborieuse, mais la mise en œuvre peut être difficile. Ici, nous décrivons un dispositif de traitement cellulaire nouvellement développé qui convient au traitement cellulaire à petite et moyenne échelle et vise à combler l’écart entre le traitement manuel et l’automatisation à grande échelle. Ce protocole peut être facilement appliqué à divers types et processus cellulaires en modifiant le débit et la vitesse de centrifugation. Notre protocole a démontré la récupération élevée de cellules avec des temps de traitement plus courts par rapport au processus manuel. Les cellules récupérées du processus automatisé ont également maintenu leurs taux de prolifération. L’appareil peut être appliqué comme un composant modulaire dans un processus de fabrication fermé pour accueillir des étapes telles que l’échange de tampons, la formulation cellulaire, et la cryoconservation.
Introduction
Le paysage de la médecine moderne s’est rapidement transformé grâce aux développements récents des thérapies géniques et cellulaires (TCM). En tant que l’un des domaines de la recherche translationnelle qui connaît la croissance la plus rapide, le secteur de la GCT est également confronté à des défis uniques et sans précédent. En plus des résultats cliniques robustes, des procédés de fabrication efficaces et rentables sont essentiels au succès commercial de GCT, qui est particulièrement difficile à réaliser dans la fabrication à petite échelle1. Le coût du temps, du travail et des assurances de qualité est amplifié lorsque chaque lot de cellules ne produit que quelques doses pour un patient au lieu de centaines ou de milliers. Contrairement aux thérapies cellulaires allogéniques dans lesquelles les processus de fabrication s’apparentent davantage à la production d’anticorps et de protéines recombinantes, les thérapies cellulaires autologues sont généralement produites sous forme d’opérations à petite échelle1. Comme un phénomène relativement nouveau dans la fabrication biopharmaceutique2, les options pour le traitement des cellules à petite échelle sont actuellement assez limitées.
L’échange de tampons est essentiel à la fabrication de cellules. C’est l’un des processus en aval où les cellules sont retirées des cultures et concentrées pour la cryoconservation ou l’infusion. À l’heure actuelle, la fabrication de petites cellules applique souvent des procédés semblables à ceux du milieu de la recherche universitaire et s’appuie sur des salles blanches spécialisées pour maintenir la stérilité3. Les processus manuels en aval utilisent souvent des centrifugeuses de banc pour granuler et resuspendre les cellules pour la réduction du volume et l’échange de tampons. Ces procédés ouverts sont coûteux (c.-à-d., la main-d’œuvre et l’entretien de la pièce propre) et ont une capacité de fabrication limitée, qui ne sont pas idéales pour la production commerciale2,3.
La mise en œuvre de l’automatisation a été proposée comme solution pour améliorer l’efficacité de la fabrication et réaliser des productions à l’échelle commerciale2. La stérilité ne peut pas être atteinte dans les produits à base de cellules par des méthodes traditionnelles utilisées pour les produits biologiques, tels que l’irradiation gamma ou la filtration terminale. Au lieu de cela, un système fermé automatisé est déployé pour réduire les risques de contamination et les opérateurs comptent sur des salles propres pour maintenir la stérilité4. L’automatisation des processus aborde également la question de l’évolutivité en ayant plusieurs systèmes fonctionnant en parallèle (échelle) ou en augmentant la capacité de traitement d’un appareil individuel (mise à l’échelle), ce qui minimise la variabilité entre les opérateurs. En outre, l’analyse de modélisation des coûts des thérapies autologues suggère que l’automatisation peut réduire le coût de fabrication5,6. Cependant, aucun avantage de coût n’a été trouvé dans un essai clinique autologous de cellules souches où une plate-forme automatisée de fabrication a été employée7,suggérant que l’avantage de coût de l’automatisation peut dépendre du processus individuel de fabrication.
Il existe différentes stratégies dans lesquelles l’automatisation peut être introduite dans un processus de fabrication existant. Cela peut être réalisé soit en mettant en œuvre une plate-forme entièrement intégrée, soit en tant que chaîne de traitement modulaire. Il existe plusieurs plates-formes entièrement intégrées disponibles dans le commerce pour la fabrication de cellules autologues, telles que CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Octane Biotech) et Quantum (Terumo BCT). Ces plates-formes intégrées, souvent décrites comme « GMP-in-a-box », ont peu de demandes d’infrastructure et sont faciles à utiliser. Toutefois, la capacité de fabrication d’une configuration entièrement intégrée peut être limitée par l’incubateur attaché au système. Par exemple, la capacité de culture de Prodigy est limitée à sa chambre8 de 400 ml et la cartouche Quantum a une surface limitante fixée à 2,1 m2 (équivalent à 120 flacons T175)7, ce qui peut ne pas être suffisant pour les patients nécessitant des doses cellulaires plus élevées9,10. En outre, Prodigy et Quantum ont un attribut commun qui limite leur utilisation: l’unité opérationnelle est occupée par un seul lot de cellules tout au long de la période d’expansion cellulaire, limitant ainsi le nombre de lots qui peuvent être fabriqués par chaque unité11. L’approche modulaire de l’automatisation est de créer une chaîne de fabrication avec plusieurs unités modulaires qui simule le processus de fabrication commerciale12,13. Cette approche, qui sépare le dispositif de culture du dispositif de lavage de cellules, peut ainsi maximiser l’efficacité de fabrication. Un dispositif de traitement idéal serait celui qui est adaptable et évolutif aux besoins de fabrication12.
La technologie de centrifugation de contre-flux (CFC), qui remonte aux années 1970, a eu une longue histoire dans le traitement cellulaire14. Il atteint la concentration cellulaire et la séparation en équilibrant la force centrifuge avec une force de contre-flux. Typiquement, une suspension cellulaire entre de l’extrémité étroite d’une chambre cellulaire sous un débit constant alors qu’elle est soumise à une force centrifuge (figure 1A). Le flux du fluide est exercé dans la direction opposée à la force centrifuge. C’est ce qu’on appelle la force de contre-flux, qui forme un gradient dans la chambre cellulaire. La force de contre-flux diminue alors que la chambre cellulaire s’élargit loin de la pointe de la chambre cellulaire en forme de cône. Les cellules avec une densité plus élevée et un diamètre plus grand ont un taux de sédimentation plus élevé, et ainsi elles atteignent l’équilibre de force vers la pointe de la chambre cellulaire en forme de cône. Les particules plus petites peuvent atteindre l’équilibre vers la base de la chambre ou être trop petites pour être retenues dans la chambre et seront emportées. La technologie CFC est surtout connue pour son application dans le traitement des produits d’apheresis sanguin, tels que l’isolation des monocytes pour les thérapies cellulaires dendritiques15,16. En termes d’échange de tampons, la technologie CFC n’a été appliquée que dans la fabrication à grande échelle17 et n’a pas encore été utilisée pour la fabrication à plus petite échelle de thérapies cellulaires autologues.
Pour répondre au besoin d’un dispositif approprié pour la fabrication de cellules à petite échelle, un dispositif cFC automatisé (Voir tableau des matériaux),a été récemment développé18. Le dispositif automatisé de traitement cellulaire utilise la technologie de centrifugation de contre-flux pour enlever les débris cellulaires et faciliter l’échange de tampons. L’appareil effectue un échange de mémoire tampon avec un kit à usage unique qui peut être relié stérile à un sac de transfert de cellules, ce qui permet aux cellules d’être traitées dans un système stérile et fermé. Ici, nous étudions l’utilisation d’un dispositif centrifuge de contre-flux pour effectuer l’échange de tampons dans les cultures cellulaires de mammifères dans des protocoles automatisés. Dans cette étude, nous avons testé le protocole d’échange de tampons à l’aide de cellules Jurkat et de cellules stromal mésenchymales (MSCs) pour modéliser les types de cellules non adhérentes et adhérentes, respectivement. Les cellules Jurkat sont des lymphocytes T immortalisés souvent utilisés pour l’étude de la leucémie t cellulaire aigue19,20. Les MSC sont des cellules souches adultes qui ont été étudiées dans le domaine des essais cliniques chez l’homme pour un large éventail de maladies9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole d’échange de mémoire tampon automatisé décrit est simple et convivial. Néanmoins, il y a quelques étapes clés dans ce protocole qui sont critiques et nécessitent une attention particulière. D’après notre expérience, lors du traitement de cellules plus grandes telles que les MSC (diamètre moyen de 10 à 15 m), chaque course devrait inclure au moins 1 x 107 cellules pour atteindre une récupération optimale des cellules (Figure 4B). Le trai…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est appuyé par le Programme de soutien à l’infrastructure opérationnelle du gouvernement de l’État de Victoria et le bon de technologie du gouvernement victorien fourni par le ministère du Développement économique, de l’Emploi, des Transports et des Ressources. RL est le récipiendaire d’une bourse de perfectionnement professionnel du Conseil national de la santé et de la recherche médicale. AL est le récipiendaire d’un Australian Postgraduate Award.
Materials
| 20 ml Luer lock syringes | BD | 302830 |
| 20% Human serum albumin (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma-Aldrich | 156477-25g |
| 500ml IV saline bag | Fresenius Kabi | K690521 |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240112 |
| Automated cell counter (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A |
| Cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 |
| Cell stimulation cocktail (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 |
| Cell transfer bags | Terumo | T1BBT060CBB |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| DMEM: F12 media | Thermo Fisher Scientific | 11320082 |
| EnVision plate Reader | Perkin Elmer | N/A |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 |
| Human Interleukin 2 (IL2) Kit | Perkin Elmer | Al221C |
| Luer (female) fittings | CPC | LF41 |
| PC laptop or PC tablet device | ASUS | N/A |
| Plate reader (SpectraMax i3) | Molecular Device | N/A |
| Recombinant Human IFN-γ | PeproTech | 300-02 |
| Rotea counterflow centrifuge cell processing device | Scinogy | N/A |
| Rotea single-use processing kit | Scinogy | N/A |
| RPMI media | Thermo Fisher Scientific | 11875119 |
| Surgical scissors | ProSciTech | 420SS |
| Trichloroacetic acide | Sigma-Aldrich | T6399-250g |
| Trypan Blue stain | Thermo Fisher Scientific | T10282 |
| Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
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