Geautomatiseerd centrifugale systeem voor kleinschalige Celverwerking

Summary

Automatisering is de sleutel tot opschaling en kostenbeheer in celproductie. Dit manuscript beschrijft het gebruik van een tegenstroom centrifugale celverwerkings inrichting voor het automatiseren van de buffer uitwisseling en celconcentratie stappen voor kleinschalige bioprocessing.

Abstract

Succesvolle commercialisering van gen-en cel-gebaseerde therapieën vereist productieprocessen die kosteneffectief en schaalbaar zijn. Buffer uitwisseling en productconcentratie zijn essentiële onderdelen voor de meeste productieprocessen. In de vroege stadia van productontwikkeling worden deze stappen echter vaak handmatig uitgevoerd. Handmatige Dead-End-centrifugeren voor buffer uitwisseling is arbeidsintensieve, dure en niet schaalbaar. Een gesloten geautomatiseerd systeem kan deze moeizame stap effectief elimineren, maar de implementatie kan een uitdaging zijn. Hier beschrijven we een nieuw ontwikkeld apparaat voor celverwerking dat geschikt is voor kleine tot middelgrote celverwerking en is bedoeld om de kloof tussen handmatige verwerking en grootschalige automatisering te overbruggen. Dit protocol kan eenvoudig worden toegepast op verschillende celtypen en processen door het debiet en de centrifugeersnelheid te wijzigen. Ons protocol toonde een hoog celherstel met Kortere verwerkingstijden in vergelijking met het handmatige proces. Cellen hersteld van het geautomatiseerde proces ook gehandhaafd hun proliferatie tarieven. Het apparaat kan worden toegepast als een modulair onderdeel in een gesloten fabricageproces om stappen zoals buffer uitwisseling, celformulering en cryopreservation te accommoderen.

Introduction

Het landschap van de moderne geneeskunde is snel getransformeerd door recente ontwikkelingen in genand Cell-based therapieën (GCT). Als een van de snelst groeiende velden in translationeel onderzoek, wordt de GCT-sector ook geconfronteerd met unieke en ongekende uitdagingen. Naast robuuste klinische uitkomsten zijn efficiënte en kosteneffectieve productieprocessen essentieel voor het commerciële succes van GCT, dat bijzonder moeilijk te bereiken is in kleinschalige productie¹. De kosten van tijd, arbeid en kwaliteitsgaranties worden vergroot wanneer elke batch cellen slechts een paar doses voor één patiënt produceert in plaats van honderden of duizenden. In tegenstelling tot allogene celtherapieën waarbij de productieprocessen meer verwant zijn aan de productie van antilichamen en recombinant eiwitten, worden autologe celtherapieën meestal geproduceerd als kleinschalige operaties¹. Als een relatief nieuw fenomeen in biofarmaceutische productie²zijn opties voor kleinschalige celverwerking momenteel vrij beperkt.

Buffer uitwisseling is essentieel voor de productie van cellen. Het is een van de downstream processen waar cellen worden verwijderd uit de cultuur media en geconcentreerd voor cryopreservatie of infusie. Op dit moment past kleinschalige celfabricage vaak processen toe die vergelijkbaar zijn met die in de academische onderzoeksinstelling en vertrouwt op gespecialiseerde schone kamers om steriliteit³te handhaven. Handmatige downstream processen gebruiken vaak tafel-centrifuges voor pellet-en respendeer cellen voor volume reductie en buffer uitwisseling. Deze open processen zijn kostbaar (d.w.z. het onderhoud van werk en schone kamers) en hebben een beperkte productiecapaciteit, die niet ideaal zijn voor commerciële productie^2,3.

De implementatie van automatisering is voorgesteld als een oplossing voor het verbeteren van de productie-efficiëntie en het behalen van commerciële schaal producties². Steriliteit kan niet worden bereikt in op cellen gebaseerde producten via traditionele methoden die worden gebruikt voor Biologics, zoals gammastraling of terminale filtratie. In plaats daarvan wordt een geautomatiseerd gesloten systeem ingezet om de Risico’s van verontreiniging te verminderen en exploitanten die vertrouwen op schone ruimten om steriliteit⁴te handhaven. Procesautomatisering lost ook de kwestie van schaalbaarheid op door ofwel meerdere systemen parallel (scale-out) te hebben of de verwerkingscapaciteit van een afzonderlijk apparaat (scale-up) te vergroten, wat op zijn beurt de variabiliteit tussen operators minimaliseert. Bovendien suggereert kostenmodellering analyse van autologe therapieën dat automatisering de kosten van de productie van^5,6kan verminderen. Er werd echter geen kostenvoordeel gevonden in een autologe stamcel klinische proef waarbij een geautomatiseerd fabricage platform werd gebruikt⁷, wat suggereert dat het kostenvoordeel van automatisering kan afhangen van het individuele fabricageproces.

Er zijn verschillende strategieën waarin automatisering kan worden geïntroduceerd in een bestaand productieproces. Dit kan worden bereikt door het implementeren van een volledig geïntegreerd platform of een modulaire verwerkingsketen. Er zijn verschillende volledig geïntegreerde platforms die commercieel beschikbaar zijn voor autologe celproductie, zoals CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Octane Biotech) en Quantum (Terumo BCT). Deze geïntegreerde platforms, die vaak worden omschreven als “GMP-in-a-Box”, hebben lage eisen aan infrastructuur en zijn eenvoudig te bedienen. De productiecapaciteit van een volledig geïntegreerde installatie kan echter worden beperkt door de incubator die aan het systeem is bevestigd. Zo is het kweek vermogen van Prodigy beperkt tot zijn 400 ml kamer⁸ en heeft de Quantum cartridge een begrenzings oppervlak ingesteld op 2,1 m² (overeenkomend met 120 T175 kolven)⁷, wat mogelijk niet voldoende is voor patiënten die hogere celdoses^9,10nodig hebben. Daarnaast hebben Prodigy en Quantum een gemeenschappelijk attribuut dat het gebruik ervan beperkt: de operationele eenheid wordt bezet door een enkele partij cellen gedurende de celuitbreidingsperiode, waardoor het aantal batches dat door elke eenheid kan worden geproduceerd¹¹wordt beperkt. De modulaire aanpak van automatisering is het creëren van een productieketen met meerdere modulaire units die het commerciële productieproces van^12,13simuleert. Deze aanpak, die het cultuur apparaat van de celwasinrichting scheidt, kan daardoor de efficiëntie van de productie maximaliseren. Een ideaal verwerkings apparaat zou er een zijn die aanpasbaar en schaalbaar is voor productiebehoeften¹².

Tegenstroom centrifugeren (CFC) technologie, die dateert uit de jaren 1970, heeft een lange geschiedenis in cel verwerking¹⁴. Het bereikt celconcentratie en scheiding door centrifugale kracht te balanceren met een tegenstroom kracht. Normaalgesproken komt een celsuspensie van het smalle uiteinde van een celkamer onder een constant debiet terwijl het wordt onderworpen aan een centrifugale kracht (Figuur 1a). De stroom van de vloeistof wordt uitgeoefend in de tegenovergestelde richting van de centrifugale kracht. Dit wordt de tegenstroom kracht genoemd, die een gradiënt vormt binnen de cel kamer. De tegenstroom kracht neemt dan af naarmate de celkamer uit de punt van de kegelvormige celkamer verwijdt. Cellen met een hogere dichtheid en een grotere diameter hebben een hogere sedimentatie snelheid, waardoor ze een kracht evenwicht bereiken naar de punt van de kegelvormige celkamer. Kleinere deeltjes kunnen een evenwicht bereiken naar de basis van de kamer of te klein zijn om in de kamer te worden bewaard en zullen worden weggespoeld. De CFC-technologie is vooral bekend om zijn toepassing bij de verwerking van bloed aferese producten, zoals het isoleren van monocyten voor dendritische celtherapieën^15,16. In termen van buffer uitwisseling is de CFC-technologie alleen toegepast in grootschalige productie¹⁷ en moet deze nog worden gebruikt voor de kleinschalige productie van autologe celtherapieën.

Om de noodzaak van een geschikt apparaat voor kleinschalige celfabricage aan te pakken, werd onlangs een geautomatiseerd CFC-apparaat (Zie tabel van de materialen) ontwikkeld¹⁸. Het geautomatiseerde celverwerkings apparaat maakt gebruik van de technologie voor het verwijderen van het celafval en vergemakkelijkt de buffer uitwisseling. Het apparaat voert buffer uitwisseling uit met een Kit voor eenmalig gebruik die steriel kan worden aangesloten op een zak voor het overbrengen van een cel, waardoor de cellen in een steriel, ingesloten systeem kunnen worden verwerkt. Hier onderzoeken we het gebruik van een tegenstroom centrifugale apparaat om buffer uitwisseling in zoogdier celculturen in geautomatiseerde protocollen uit te voeren. In deze studie testten we het protocol voor buffer uitwisseling met behulp van Jurkat-cellen en mesenchymale stromale cellen (MSCs) om respectievelijk niet-aanhandige en aanhandige celtypen te modelleren. Jurkat cellen zijn vereeuwigd t cellen vaak gebruikt voor de studie van acute T-cel leukemie^19,20. MSCs zijn volwassen stamcellen die zijn bestudeerd in menselijke klinische studies voor een breed scala aan ziekten⁹.

Protocol

1. bereiding van reagentia en cellen voor buffer uitwisseling Buffers voorbereiden (Zie tabel met materialen) in een klasse 2 laminaire stroom afzuigkap. Verwijder met behulp van een spuit en naald assemblage 50 mL zoutoplossing uit een 500 mL zoute zak. Vervang dit met 50 mL van 20% humaan serumalbumine (HSA) om 2% HSA in zoutoplossing te maken, die als de wasbuffer dient. Verwijder de cellen uit de kweekvaten en voer een celtelling uit om de Beginhoeveelheid van de cel en de levensv…

Representative Results

In dit protocol gebruikten we Jurkat-cellen en MSCs als representatieve voorbeelden om het geautomatiseerde buffer uitwisselingsproces aan te tonen. Tijdens het proces deelden Jurkat-cellen en MSCs dezelfde verwerkingsstappen met verschillen in centrifugale kracht en pompsnelheid die de stroomsnelheid regelen (tabel 1). Figuur 2 toont representatieve beelden die zijn vastgelegd door de camera van hoe het wervelbed van de cel kan verschijnen tijdens het proces van de buffer w…

Discussion

Het protocol voor automatische buffer uitwisseling dat wordt beschreven, is eenvoudig en gebruiksvriendelijk. Niettemin zijn er een paar belangrijke stappen in dit protocol die kritisch zijn en bijzondere aandacht vereisen. In onze ervaring, bij de verwerking van grotere cellen zoals MSCs (gemiddelde diameter 10 – 15 μm) elke run moet bevatten ten minste 1 x 10⁷ cellen om optimale celherstel te bereiken (Figuur 4B). Het verwerken van kleinere cellen, zoals Jurk…

Materials

20 ml Luer lock syringes	BD	302830
20% Human serum albumin (HSA)	CSL Behring	AUST R 46283
4-(Dimethylamino)benzaldehyde	Sigma-Aldrich	156477-25g
500ml IV saline bag	Fresenius Kabi	K690521
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240112
Automated cell counter (Countess)	Thermo Fisher Scientific	N/A
Cell counting chamber slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
Cell stimulation cocktail (500x)	Thermo Fisher Scientific	00-4970-93
Cell transfer bags	Terumo	T1BBT060CBB
CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G3582
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM: F12 media	Thermo Fisher Scientific	11320082
EnVision plate Reader	Perkin Elmer	N/A
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10099141
Human Interleukin 2 (IL2) Kit	Perkin Elmer	Al221C
Luer (female) fittings	CPC	LF41
PC laptop or PC tablet device	ASUS	N/A
Plate reader (SpectraMax i3)	Molecular Device	N/A
Recombinant Human IFN-γ	PeproTech	300-02
Rotea counterflow centrifuge cell processing device	Scinogy	N/A
Rotea single-use processing kit	Scinogy	N/A
RPMI media	Thermo Fisher Scientific	11875119
Surgical scissors	ProSciTech	420SS
Trichloroacetic acide	Sigma-Aldrich	T6399-250g
Trypan Blue stain	Thermo Fisher Scientific	T10282
Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme)	Thermo Fisher Scientific	12604013