اعداد الميتوكوندريا من انسجه سرطان المبيض والتحكم في انسجه المبيض للتحليل الكمي للبروبروتيميكس
Summary
تقدم هذه المقالة بروتوكولا لطرد التفاضلية السرعة في تركيبه مع طرد التدرج الكثافة لفصل الميتوكوندريا من انسجه سرطان المبيض البشرية والتحكم في انسجه المبيض للتحليل الكمي للبروبروتيميكس ، مما ادي إلى عينه عاليه الجودة الميتوكوندريا وعاليه الانتاجيه وعاليه الاستنساخ تحليل البروتين النوعي لسرطان المبيض الميتوكوندريا بروسوم الإنسان.
Abstract
سرطان المبيض هو سرطان الامراض النسائية الشائعة مع ارتفاع معدل الوفاات ولكن اليه الجزيئية غير واضحة. يتم تشخيص معظم سرطانات المبيض في المرحلة المتقدمة ، والتي تعيق العلاج بشكل خطير. التغييرات الميتوكوندريا هي السمة المميزة لسرطان المبيض البشري ، والميتوكوندريا هي مراكز استقلاب الطاقة ، وإشارات الخلية ، والاكسده. والرؤى المتعمقة في التغيرات من بروسوم الميتوكوندريا في سرطان المبيض مقارنه بالتحكم في انسجه المبيض سوف تستفيد من فهم متعمق للأليات الجزيئية لسرطان المبيض ، واكتشاف المؤشرات الحيوية الفعالة والموثوقه والأهداف العلاجية. يتم تقديم طريقه فعاله لاعداد الميتوكوندريا إلى جانب علامة ايزوماريك للقياس الكمي النسبي والمطلق (iTRAQ العراق) البروتينية الكمية هنا لتحليل سرطان المبيض البشري والسيطرة علي البروتينات المتقدريه ، بما في ذلك طرد التفاضلية السرعة ، طرد التدرج الكثافة ، وتقييم جوده عينات الميتوكوندريا ، وهضم البروتين مع التريبسين ، ووضع العلامات في العراق ، وتجزئه تبادل الموجبات القوية (اس اس) ، واللوني السائل (LC) ، والطيف الكتلي الترادفي (MS/ MS) ، وتحليل قاعده البيانات ، والتحليل الكمي للبروتينات الميتوكوندريا. وقد تم التعرف علي العديد من البروتينات بنجاح لتحقيق اقصي قدر من التغطية لسرطان المبيض الميتوكوندريا بروتينيه البشرية والتعبير عن مختلف بشكل مختلف الشخصية البروتين الميتوكوندريا في سرطان المبيض البشري.
Introduction
سرطان المبيض هو سرطان الامراض النسائية الشائعة مع ارتفاع معدل الوفاات ولكن اليه الجزيئية غير واضحة1,2. يتم تشخيص معظم سرطانات المبيض في المرحلة المتقدمة ، والتي تعيق العلاج بشكل خطير. التغييرات الميتوكوندريا هي السمة المميزة لسرطان المبيض البشري ، والميتوكوندريا هي مراكز استقلاب الطاقة ، وإشارات الخلية ، والاكسده3،4،5،6،7. والرؤى المتعمقة في التغيرات من بروسوم الميتوكوندريا في سرطان المبيض مقارنه بالتحكم في انسجه المبيض سوف تستفيد من فهم متعمق للأليات الجزيئية لسرطان المبيض ، واكتشاف المؤشرات الحيوية الفعالة والموثوقه والأهداف العلاجية. وقد اقترح الأيض الميتوكوندريا والمعترف بها كهدف لعلاج السرطان, والعلاج المتقدرات قد تكون في نهاية المطاف مفيده جدا لمنع تكرار وورم خبيث من السرطان8. التنميط الأيضي الفردية كما يمارس بالفعل كاداه مفيده لتقسيم السرطان الطبقية والاستراتيجيات التنبؤيه9,10.
الهدف علي المدى الطويل من هذا البحث هو تطوير واستخدام طريقه بروتينيه الميتوكوندريا الكمية لدراسة سرطان المبيض لتوضيح التعديلات بروميتومي الميتوكوندريا بين سرطان المبيض والسيطرة علي انسجه المبيض ، والتعديلات شبكتهم الجزيئية من المنهجية متعددة الomics زاوية11،12، والتي سوف تؤدي إلى اكتشاف الميتوكوندريا-البيولوجية الجزيئية المستهدفة13 لتوضيح أليات الجزيئية لسرطان المبيض ، التنبؤ ، والعلاج الشخصي لمرضي سرطان المبيض. علامات ايزوماريك للقياس الكمي النسبي والمطلق (itraq العراق) وضع العلامات3,4 هي طريقه فعاله لقياس التغيرات البروتين الميتوكوندريا. اعداد عينات الميتوكوندريا عاليه الجودة من سرطان المبيض البشري والسيطرة علي انسجه المبيض هي الشرط المسبق للتحليل الكمي لل iTRAQ العراق من البروتينات المتقدريه3. تغييرات الشبكة في سرطان المبيض البشري5, بما في ذلك التعديلات في استقلاب الطاقة4, استقلاب الدهون, وميتوفاجي المسار-نظم3.
وقد وجدت الدراسات السابقة ان طرد التفاضلية السرعة في تركيبه مع طرد التدرج الكثافة هو وسيله فعاله لعزل وتنقيه الميتوكوندريا من سرطان المبيض البشري والسيطرة علي انسجه المبيض3,4,5,14. الوسم iTRAQ العراق مقرونا بتبادل الموجبة قويه (سي اس)-اللوني السائل (LC)-ترادفي الطيف الكتلي (MS/MS) هو الأسلوب الرئيسي للكشف عن وتحديد وقياس البروتينات من عينات الميتوكوندريا المعدة.
هنا ، يتم وصف البروتوكولات المفصلة لاعداد الميتوكوندريا إلى جانب البروتينات البروتينية الكمية. وقد استخدمت هذه بنجاح في تحليل الإنسان المبيض الانسجه السرطانية الميتوكوندريا. وتشمل البروتوكولات اعداد العينات ، طرد تفاضلية السرعة ، طرد التدرج الكثافة ، وتقييم جوده عينات الميتوكوندريا ، وهضم البروتين مع التريبسين ، ووضع العلامات في العراق ، والتجزئة ، LC ، MS/MS ، والبحث في قاعده البيانات ، والتحليل الكمي للبروتينات المتقدريه. وعلاوة علي ذلك ، هذا البروتوكول يترجم بسهوله لتحليل الانسجه البشرية الأخرى الميتوكوندريا البروتينية.
Protocol
Representative Results
Discussion
التعديلات الميتوكوندريا هي السمة المميزة لسرطان المبيض. طرد التفاضلية السرعة في تركيبه مع التدرج الكثافة طرد بشكل فعال المعزولة وتنقيه الميتوكوندريا من سرطان المبيض البشري والسيطرة علي انسجه المبيض. وكانت عينات الميتوكوندريا المعدة ذ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظي هذا العمل بدعم خطه المواهب في مقاطعه هونان (إلى X.Z.) ، وصندوق مستشفي شيانغيا لتقديم المواهب (إلى XZ) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 81572278 و 81272798 إلى XZ) ، والمنح المقدمة من الصين “863” خطه المشروع (المنحة رقم 2014AA020610-1 إلى XZ) ، ومؤسسه هونان للعلوم الطبيعية الاقليميه في الصين (المنحة رقم 14C 7008 إلى XZ). تصورت X.Z. مفهوم المخطوطة الحالية ، وحصلت علي بيانات البروتين البروتيني الكمية لعينات الميتوكوندريا ، وكتبت ونقحت المخطوطة ، ونسقت العمل ذي الصلة ، وكانت مسؤوله عن الدعم المالي وما يقابله من العمل. H.L. اعداد عينات الميتوكوندريا. شاركت S.Q. في العمل الجزئي. شاركت الشركة في كتابه وتحرير اللغة الانجليزيه. N.L. تحليل البيانات البروتينية iTRAQ العراق. ووافق جميع المؤلفين علي المخطوطة النهائية.
Materials
| BCA protein assay kit | Vazyme | E112 | BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98% |
| Centrifuge | XiangYi | TDZ4–WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
| Diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific) | ||
| Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥97 .0% |
| Homogenizer | SilentShake | HYQ-3110 | |
| iTRAQ reagent kit | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A | |
| Low-temperature super-speed centrifuger | Eppendorf | 5424R | |
| Mannitol | Macklin | M813424-100G | Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency. |
| MASCOT search engine | Matrix Science, London, UK; version 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-hydroxysuccinimide (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥97.0% (T) |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor | Solarbio | P0100-1ML | PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain. |
| Potassium chloride | Macklin | P816354-25G | Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute. |
| Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, London, UK | ||
| PVDF membrane | Millipore | 05317 | It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes. |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCX column | Sigma | 58997 | It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco). |
| Sodium orthovanadate (V) | Macklin | S817660-25G | Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution. |
| Sucrose | Macklin | S824459-500G | Vetec reagent grade, 99% |
| Thiourea | Sigma | 62-56-6 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Tris base | Sigma | 10708976001 | TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C. |
| Trypsin (cell culture use) | Gibco | 25200-056 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. |
| Urea | Sigma | U5378-100G | powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture |
References
- Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57 (2017).
- Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
- Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
- Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
- Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
- Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
- Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of “free radical diseases”. Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
- Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
- Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
- Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
- Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
- Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2 (2013).
- Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
- Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
- McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455 (2018).
- Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
- Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841 (2017).
- Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. Peroxisome-mitochondria interplay and disease. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).
- Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812 (2017).
- Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
- Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
- Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008 (2018).
