Yumurtalık Kanseri Dokularından Mitokondri Hazırlanması ve Kantitatif Proteomik Analizi Için Yumurtalık Dokularının Kontrolü
Summary
Bu makalede, insan yumurtalık kanseri dokularından mitokondriyi ayırmak ve kantitatif proteomik analiziçin yumurtalık dokularını kontrol etmek için yoğunluk gradyan santrifüj santrifüjü ile birlikte diferansiyel hız santrifüjü protokolü sunmaktadır. bir insan yumurtalık kanseri mitokondriyal proteom yüksek kaliteli mitokondriyal örnek ve yüksek üretim ve yüksek tekrarlanabilirlik kantitatif proteomik analizi ile sonuçlanan.
Abstract
Yumurtalık kanseri yüksek mortalite ama belirsiz moleküler mekanizma ile ortak bir jinekolojik kanserdir. Çoğu yumurtalık kanseri ileri evrede teşhis edilir, hangi ciddi tedavi engellenir. Mitokondriyal değişiklikler insan yumurtalık kanserlerinin bir özelliğidir, ve mitokondri enerji metabolizması merkezleri, hücre sinyalizasyonu, ve oksidatif stres. Yumurtalık kanserlerinde mitokondriyal proteom değişiklikleri içine derinlemesine anlayışlar yumurtalık kanseri moleküler mekanizmalarıderinlez anlaşılması yarar sağlayacaktır, ve etkili ve güvenilir biyobelirteçleri ve terapötik hedeflerin keşfi. İnsan yumurtalık kanserini analiz etmek ve mitokondriyal proteomları kontrol etmek için göreceli ve mutlak nicel (iTRAQ) kantitatif proteomikler için bir isobarik etiketle birleşen etkili bir mitokondriyal preparat yöntemi sunulmuştur. diferansiyel hızlı santrifüj, yoğunluk gradyan santrifüj, mitokondriyal örneklerin kalite değerlendirmesi, tripsin ile protein sindirimi, iTRAQ etiketleme, güçlü katyon değişimi fraksiyonasyonu (SCX), sıvı kromatografi (LC), tandem kütle spektrometresi (MS/ MS), veritabanı analizi ve mitokondriyal proteinlerin kantitatif analizi. Birçok protein başarıyla insan yumurtalık kanseri mitokondriyal proteom kapsama maksimize etmek ve insan yumurtalık kanserlerinde farklı ifade mitokondriyal protein profili elde etmek için tespit edilmiştir.
Introduction
Yumurtalık kanseri yüksek mortalite ama belirsiz moleküler mekanizma ile ortak bir jinekolojikkanserdir 1,2. Yumurtalık kanserlerinin çoğu ileri evrede teşhis edilir, hangi ciddi tedavi engellenir. Mitokondriyal değişiklikler insan yumurtalık kanserlerinin bir özelliği, ve mitokondri enerji metabolizması merkezleri, hücre sinyal, ve oksidatif stres3,4,5,6,7. Yumurtalık kanserlerinde mitokondriyal proteom değişiklikleri içine derinlemesine anlayışlar yumurtalık kanseri moleküler mekanizmalarıderinlez anlaşılması yarar sağlayacaktır, ve etkili ve güvenilir biyobelirteçleri ve terapötik hedeflerin keşfi. Mitokondriyal metabolizma önerilmiştir ve kanser tedavisi için bir hedef olarak kabul, ve antimitokondriyal tedavi sonuçta kanser nüks ve metastaz önlemek için çok yararlı olabilir8. Bireysel metabolik profilleme de zaten kanser tabakalaşma ve tahmin stratejileriiçinyararlı bir araç olarak uygulanmış 9,10.
Bu araştırmanın uzun vadeli amacı, yumurtalık kanseri ve kontrol yumurtalık dokuları arasındaki mitokondriyal proteom değişikliklerinin açıklanması için yumurtalık kanserini incelemek için kantitatif mitokondriyal proteomik bir yöntem geliştirmek ve kullanmaktır. ve sistematik multi-omics açı11moleküler ağ değişiklikleri11 ,12, yumurtalık kanseri moleküler mekanizmalarının açıklanması için mitokondri hedefli moleküler biyobelirteçlerin keşfi neden olacak13, tahmin ve yumurtalık kanseri hastalarının kişiselleştirilmiş tedavi. Bağıl ve mutlak nicelik (iTRAQ) etiketleme için İzobarik etiketler3,4 mitokondriyal protein değişikliklerini ölçmek için etkili bir yöntemdir. İnsan yumurtalık kanseri ve kontrol yumurtalık dokularından yüksek kaliteli mitokondriyal örneklerin hazırlanması mitokondriyal proteomların iTRAQ kantitatif analizi için ön koşuldur3. Mitokondriyal hazırlık iTRAQ kantitatif proteomik ile birleştiğinde başarıyla insan yumurtalık kanseri mitokondriyal proteom hakkında uzun vadeli araştırma programlarında kullanılmıştır, mitokondriyal proteom referans haritaları kurulması da dahil olmak üzere3, diferansiyel ifade mitokondriyal profilleranalizi 4,14 ve post-çevirial değişiklikler, zaten önemli bir keşif sinyali ile sonuçlandı insan yumurtalık kanserlerinde ağ değişiklikleri5, enerji metabolizmasında değişiklikler de dahil olmak üzere4, lipid metabolizması, ve mitophagy yol sistemleri3.
Önceki çalışmalarda yoğunluk gradyan santrifüj santrifüj ile birlikte diferansiyel hız santrifüj insan yumurtalık kanseri ve kontrol yumurtalık dokularından mitokondri izole etmek ve arındırmak için etkili bir yöntem olduğunu bulduk3,4,5,14. Güçlü katyon değişimi (SCX)-sıvı kromatografisi (LC)-tandem kütle spektrometresi (MS/MS) ile birleşen iTRAQ etiketleme, hazırlanan mitokondriyal örneklerdeki proteinleri tespit etmek, tanımlamak ve ölçmek için anahtar tekniktir.
Burada iTRAQ kantitatif proteomikleri ile birleşen mitokondriyal hazırlık için ayrıntılı protokoller açıklanmıştır. Bu başarıyla insan yumurtalık kanseri doku mitokondriyal proteomların analizinde kullanılmıştır. Protokoller, numunelerin hazırlanması, diferansiyel hız santrifüjü, yoğunluk gradyan santrifüjü, mitokondriyal örneklerin kalite değerlendirmesi, tripsin ile protein sindirimi, iTRAQ etiketleme, SCX fraksiyonasyonu, LC, MS/MS, veritabanı aramave mitokondriyal proteinlerin kantitatif analizini içerir. Ayrıca, bu protokol kolayca diğer insan doku mitokondriyal proteomanaliz çevirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitokondriyal değişiklikler yumurtalık kanserinin bir özelliğidir. Büyük ölçekli kantitatif proteomikler için insan yumurtalık kanseri ve kontrol dokularından yüksek kaliteli mitokondriyal örneklerin hazırlanması yumurtalık kanseri patogenezi ve mitokondriyal moleküler ağ değişiklikleri mitokondriyal fonksiyonun derinlemesine anlaşılması yarar ve mitokondri 4 dayalı hedef tedavi ve etkili biyobelirteçleri sonraki keşif için moleküler mekanizmasını açıklığa kavuşturmak yardımcı olur ,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Hunan Provincial Hundred Talent Plan (X.Z.), Xiangya Hastanesi Yetenek Giriş Fonları (XZ), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 81572278 ve 81272798 XZ), Çin hibe “863” Planı tarafından desteklendi Proje (Hibe No. 2014AA020610-1 XZ için) ve Çin Hunan İl Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 14JJ7008 XZ için). X.Z. bu makalenin konseptini tasarladı, mitokondri örneklerinin iTRAQ kantitatif proteomik verilerini elde etti, el yazması yazdı ve revize etti, ilgili çalışmayı koordine etti ve finansal destekten ve buna karşılık gelen Çalışma. H.L. mitokondri örnekleri hazırladı. S.Q. kısmi çalışmaya katıldı. X.H.Z İngilizce’nin yazımına ve editörlüğünü aldı. N.L. iTRAQ proteomics verilerini analiz etti. Tüm yazarlar son taslağı onayladı.
Materials
| BCA protein assay kit | Vazyme | E112 | BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98% |
| Centrifuge | XiangYi | TDZ4–WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
| Diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific) | ||
| Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥97 .0% |
| Homogenizer | SilentShake | HYQ-3110 | |
| iTRAQ reagent kit | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A | |
| Low-temperature super-speed centrifuger | Eppendorf | 5424R | |
| Mannitol | Macklin | M813424-100G | Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency. |
| MASCOT search engine | Matrix Science, London, UK; version 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-hydroxysuccinimide (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥97.0% (T) |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor | Solarbio | P0100-1ML | PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain. |
| Potassium chloride | Macklin | P816354-25G | Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute. |
| Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, London, UK | ||
| PVDF membrane | Millipore | 05317 | It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes. |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCX column | Sigma | 58997 | It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco). |
| Sodium orthovanadate (V) | Macklin | S817660-25G | Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution. |
| Sucrose | Macklin | S824459-500G | Vetec reagent grade, 99% |
| Thiourea | Sigma | 62-56-6 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Tris base | Sigma | 10708976001 | TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C. |
| Trypsin (cell culture use) | Gibco | 25200-056 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. |
| Urea | Sigma | U5378-100G | powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture |
References
- Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57 (2017).
- Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
- Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
- Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
- Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
- Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
- Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of “free radical diseases”. Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
- Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
- Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
- Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
- Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
- Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2 (2013).
- Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
- Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
- McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455 (2018).
- Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
- Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841 (2017).
- Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. Peroxisome-mitochondria interplay and disease. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).
- Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812 (2017).
- Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
- Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
- Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008 (2018).
