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Cancer Research

Preparación de Mitocondrias a partir de tejidos de cáncer de ovario y tejidos ováricos de control para el análisis proteómico cuantitativo

Published: November 18, 2019 doi: 10.3791/60435
Automatic Translation
1,2,3,4, 5, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4National Clinical Research Center for Geriatric Disorders, Xiangya Hospital, Central South University, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Xiangya Hospital, Central South University

Summary

Este artículo presenta un protocolo de centrifugación de velocidad diferencial en combinación con centrifugación de gradiente de densidad para separar las mitocondrias de los tejidos de cáncer de ovario humano y controlar los tejidos ováricos para el análisis proteómico cuantitativo, resultando en una muestra mitocondrial de alta calidad y un análisis proteómico cuantitativo de alta calidad y alta reproducibilidad de un proteomo mitocondrial de cáncer de ovario humano.

Abstract

El cáncer de ovario es un cáncer ginecológico común con alta mortalidad pero mecanismo molecular poco claro. La mayoría de los cánceres de ovario se diagnostican en la etapa avanzada, lo que dificulta gravemente la terapia. Los cambios mitocondriales son un sello distintivo de los cánceres de ovario humano, y las mitocondrias son los centros del metabolismo energético, la señalización celular y el estrés oxidativo. La comprensión en profundidad de los cambios del proteoma mitocondrial en los cánceres de ovario en comparación con el control del tejido ovárico beneficiará la comprensión profunda de los mecanismos moleculares del cáncer de ovario, y el descubrimiento de biomarcadores y dianas terapéuticas eficaces y confiables. Aquí se presenta un método eficaz de preparación mitocondrial junto con una etiqueta isobárica para la proteómica cuantitativa de cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) para analizar el cáncer de ovario humano y controlar los proteomes mitocondriales, incluyendo centrifugación de velocidad diferencial, centrifugación de gradiente de densidad, evaluación de la calidad de muestras mitocondriales, digestión proteica con trippsina, etiquetado iTRAQ, fraccionamiento de intercambio catiónico fuerte (SCX), cromatografía líquida (LC), espectrometría de masas en tándem (MS/ MS), análisis de bases de datos y análisis cuantitativo de proteínas mitocondriales. Muchas proteínas se han identificado con éxito para maximizar la cobertura del proteome mitocondrial del cáncer de ovario humano y para lograr el perfil de proteína mitocondrial expresado diferencialmente en cánceres de ovario humano.

Introduction

El cáncer de ovario es un cáncer ginecológico común con alta mortalidad pero mecanismo molecular poco claro1,2. La mayoría de los cánceres de ovario se diagnostican en la etapa avanzada, lo que dificulta seriamente la terapia. Los cambios mitocondriales son un sello distintivo de los cánceres de ovario humano, y las mitocondrias son los centros del metabolismo energético, la señalización celular y el estrés oxidativo3,4,5,6,7. La comprensión en profundidad de los cambios del proteoma mitocondrial en los cánceres de ovario en comparación con el control del tejido ovárico beneficiará la comprensión profunda de los mecanismos moleculares del cáncer de ovario, y el descubrimiento de biomarcadores y dianas terapéuticas eficaces y confiables. El metabolismo mitocondrial ha sido propuesto y reconocido como un objetivo para la terapia contra el cáncer, y la terapia antimitocondrial podría ser en última instancia muy beneficiosa para prevenir la recurrencia y metástasis del cáncer8. El perfilado metabólico individual también se practica como una herramienta útil para la estratificación del cáncer y las estrategias predictivas9,10.

El objetivo a largo plazo de esta investigación es desarrollar y utilizar un método proteomico mitocondrial cuantitativo cuantitativo para estudiar el cáncer de ovario para aclarar las alteraciones del proteomo mitocondrial entre el cáncer de ovario y controlar los tejidos ováricos, y sus alteraciones de la red molecular desde un ángulo multiémico sistemático11,12, que dará lugar al descubrimiento de biomarcadores moleculares dirigidos a las mitocondrias13 para la clarificación de los mecanismos moleculares del cáncer de ovario, predicción y tratamiento personalizado de los pacientes con cáncer de ovario. Las etiquetas isobáricas para la cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) etiquetado3,4 son un método eficaz para cuantificar los cambios de proteína mitocondrial. La preparación de muestras mitocondriales de alta calidad a partir de cáncer de ovario humano y tejidos ováricos de control son el requisito previo para el análisis cuantitativo iTRAQ de proteomos mitocondriales3. La preparación mitocondrial junto con la proteómica cuantitativa iTRAQ se ha utilizado con éxito en programas de investigación a largo plazo sobre el proteomo mitocondrial del cáncer de ovario humano, incluyendo el establecimiento de mapas de referencia del proteome mitocondrial3, el análisis de perfiles mitocondriales expresados diferencialmente4,14 y modificaciones post-traduccionales, incluida la fosforilación, que ya ha dado lugar al descubrimiento de importantes vías de señalización cambios en la red en los cánceres de ovario humano5, incluyendo alteraciones en el metabolismo energético4, metabolismo de los lípidos, y sistemas de vía mitophagia3.

Estudios anteriores han encontrado que la centrifugación de velocidad diferencial en combinación con centrifugación de gradiente de densidad es un método eficaz para aislar y purificar las mitocondrias del cáncer de ovario humano y controlar los tejidos ováricos3,4,5,14. El etiquetado iTRAQ junto con un fuerte intercambio catiónico (SCX)-cromatografía líquida (LC) espectrometría de masas tándem (MS/MS) es la técnica clave para detectar, identificar y cuantificar las proteínas de las muestras mitocondriales preparadas.

Aquí se describen protocolos detallados para la preparación mitocondrial junto con proteómica cuantitativa iTRAQ. Estos se han utilizado con éxito en el análisis de los proteomes mitocondriales del tejido de cáncer de ovario humano. Los protocolos incluyen preparación de muestras, centrifugación de velocidad diferencial, centrifugación de gradiente de densidad, evaluación de la calidad de muestras mitocondriales, digestión de proteínas con trippsina, etiquetado iTRAQ, fraccionamiento SCX, LC, MS/MS, búsqueda de bases de datos y análisis cuantitativo de proteínas mitocondriales. Además, este protocolo se traduce fácilmente para analizar otros proteomas mitocondriales de tejido humano.

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Protocol

Para este protocolo se utilizaron muestras de tejidos ováricos, incluidos los tejidos de cáncer de ovario (n.o 7) y los tejidos ováricos de control normal (n.o 11). El presente protocolo3,4,5 está aprobado por el Comité de ética médica del Hospital Xiangya de la Universidad Central del Sur, China.

1. Preparación de mitocondrias a partir de tejidos de cáncer de ovario humano

  1. Preparar 250 ml del tampón de aislamiento mitocondrial mezclando 210 mM de manitol, sacarosa de 70 mM, cloruro de potasio de 100 mM (KCl), 50 mM Tris-HCl, ácido tetraacético de diamina de 1 mM (EDTA), 0,1 mM de etilenglicol bis(2-éter de aminoetilo)ácido tetraacético (EGTA), 1 mM de etilenglicol bis(2-éter de aminoetilo)ácido tetraacético (EGTA), 1 mM de ácido tetraacetico (EGTA), 1 mM de etilenglicol bis(2-éter de aminoetilo))ácido tetraacético (EGTA), 1 mM inhibidor de la proteasa de fluoruro de fenilonosulfonil (PMSF), ortovanato sódico de 2 mM (V) y albúmina sérica bovina (BSA) albúme, pH 7,4.
  2. Coloque 1,5 g de tejidos de cáncer de ovario en un recipiente de vidrio limpio.
  3. Añadir 2 ml del tampón de aislamiento mitocondrial pre-enfriado para lavar ligeramente la sangre de la superficie del tejido 3x.
  4. Use tijeras oftálmicas limpias para picar completamente el tejido en aproximadamente 1 mm3 piezas, y transfiera los tejidos picados en un tubo centrífugo de 50 ml.
  5. Añadir 13,5 ml de tampón de aislamiento mitocondrial que contenga 0,2 mg/ml de nagarse, y luego utilizar un homogeneizador eléctrico para homogeneizar (utilizar la escala 2, 10 s 6x, intervalo 10 s) los tejidos picados (2 min, 4 oC).
  6. Añadir otros 3 ml de tampón de aislamiento mitocondrial en el tejido homogeneiza y mezclarlos bien pipeteando.
  7. Centrifugar el tejido preparado homogeneizar (1.300 x g,10 min, 4oC). Retire la fracción nuclear bruta (es decir, el pellet) y mantenga el sobrenadante.
  8. Recienterifule el sobrenadante (10.000 x g,10 min, 4 oC). Retire los microsomas (es decir, el sobrenadante) y mantenga el pellet.
  9. Añadir 2 ml de tampón de aislamiento mitocondrial y resuspender el pozo de pellets mediante pipeteo ligero.
  10. Centrifugar la suspensión del pellet (7.000 x g,10 min, 4oC). Deseche el sobrenadante y mantenga las mitocondrias brutas (es decir, el pellet).
  11. Añadir 12 ml de 25% de medio de gradiente de densidad (es decir, Nycodenz) para resuspender las mitocondrias brutas extraídas.
  12. Hacer un gradiente de densidad discontinua rellenando un tubo de abajo a arriba con 5 ml de 34%, 8 ml de 30%, 12 ml de 25% (que contiene las mitocondrias brutas del paso 1.11), 8 ml de 23%, y 3 ml de medio de gradiente de densidad del 20%, y centrifuge (52.000 x g,90 min, 40 min).
  13. Utilice una jeringa larga y contundente para recoger las mitocondrias purificadas en la interfaz entre el medio de gradiente de densidad del 25% y el 30% en un tubo limpio.
  14. Agregue el tampón de aislamiento mitocondrial en las mitocondrias recogidas para diluirla a un volumen triple. Centrifugar (15.000 x g,20 min, 4oC) y desechar el sobrenadante.
  15. Añadir 2 ml de tampón de aislamiento mitocondrial para resuspender el pellet y centrifugar (15.000 x g,20 min, 4oC). Deseche el sobrenadante y mantenga el pellet.
  16. Recoger el pellet final (es decir, las mitocondrias purificadas) y almacenarlo a -20 oC.
    NOTA: Combine todas las mitocondrias purificadas del tejido oncológico de ovario como muestra de mitocondrias para el análisis cuantitativo de la proteómica.

2. Preparación de mitocondrias a partir de tejidos ováricos de control humano

  1. Prepare 250 ml del tampón de aislamiento mitocondrial como se describe en el paso 1.1.
  2. Coloque 1,5 g de los tejidos ováricos de control normal en un recipiente de vidrio limpio.
  3. Añadir 2 ml de tampón de aislamiento mitocondrial pre-enfriado para lavar ligeramente la sangre de la superficie del tejido 3x.
  4. Use tijeras oftálmicas limpias para picar completamente el tejido en aproximadamente 1 mm3 piezas, y transfiera los tejidos picados en un tubo centrífugo de 50 ml.
  5. Añadir 8 ml de 0,05% de trippsina/20 mM EDTA en solución salina tamponada de fosfato (PBS) a los tejidos de control picados, y digerir (30 min, temperatura ambiente), lo que ayuda a licuar los tejidos y las células y liberar las mitocondrias. A continuación, centrífuga (200 x g, 5 min). Deseche el sobrenadante y mantenga los tejidos y las células.
  6. Añadir 13,5 ml de tampón de aislamiento mitocondrial que contenga 0,2 mg/ml de nagarse, y luego utilizar un homogeneizador eléctrico para homogeneizar (utilizar la escala 2, 10 s 6x, intervalo 10 s) los tejidos picados (2 min, 4 oC).
  7. Añadir otros 3 ml de tampón de aislamiento mitocondrial en el tejido homogeneiza y mezclarlos bien pipeteando.
  8. Centrifugar el tejido preparado homogeneizar (1.300 x g,10 min, 4oC). Retire la fracción nuclear bruta (es decir, el pellet) y mantenga el sobrenadante.
  9. Recienterifule el sobrenadante (10.000 x g,10 min, 4oC). Retire los microsomas (es decir, el sobrenadante) y mantenga el pellet.
  10. Añadir 2 ml de tampón de aislamiento mitocondrial para resuspender bien el pellet mediante pipeteo ligero.
  11. Centrifugar la suspensión del pellet (7.000 x g,10 min, 4oC). Deseche el sobrenadante y mantenga las mitocondrias brutas (es decir, el pellet).
  12. Añadir 12 ml de 25% de medio de gradiente de densidad para resuspender las mitocondrias brutas extraídas.
  13. Haga un gradiente de densidad discontinua rellenando un tubo de abajo a arriba con 8 ml de 38%, 5 ml de 34%, 8 mL de 30%, 12 mL de 25% (que contiene las mitocondrias brutas del paso 2.12), 8 mL de 23%, y 3 mL de medio gradiente de densidad del 20%, y centrifugarlo (52.000 x g,90 min, 4oC).
  14. Utilice una jeringa larga y contundente para recoger las mitocondrias purificadas en el rango de entre el 25% y el 30% a la interfaz entre 34% y 38% en un tubo limpio.
  15. Agregue el tampón de aislamiento mitocondrial en las mitocondrias recogidas para diluirla a un volumen triple. Centrifugar (15.000 x g,20 min, 4oC) y desechar el sobrenadante.
  16. Añadir 2 ml de tampón de aislamiento mitocondrial para resuspender el pellet, y centrifugarlo (15.000 x g,20 min, 4 oC). Deseche el sobrenadante y mantenga el pellet.
  17. Recoger el pellet final (es decir, las mitocondrias purificadas) y almacenarlo a -20 oC.
    NOTA: Combine todas las mitocondrias purificadas del tejido ovárico de control como muestras mitocondriales para el análisis cuantitativo de la proteómica.

3. Verificación de la calidad de las muestras mitocondriales de tejido purificado

  1. Tome un tubo de muestras mitocondriales purificadas (es decir, los pellets de los tejidos del cáncer de ovario del paso 1.16 y los tejidos ováricos de control del paso 2.17) para su verificación con microscopía electrónica (EM).
    NOTA: El protocolo detallado se describió anteriormente15,16.
  2. Preparar el tampón de extracción de proteína mitocondrial mezclando urea de 8 M, 2 M de tiourea, 40 mM Tris, 1 mM EDTA, 130 mM de ditilothreitol (TDT) y 4% (w:v) 3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanulfesonato (CHAPS). Ajuste el pH a 8,52.
  3. Tome un tubo de muestras mitocondriales purificadas (es decir, los pellets de los tejidos de cáncer de ovario en el paso 1.16 y los tejidos ováricos de control en el paso 2.17) y agregue el tampón de extracción de proteína mitocondrial (muestras mitocondriales al tampón de extracción de proteínas, 1:5) resuspender el pellet. Congele las muestras en nitrógeno líquido 3x y guárdelas a temperatura ambiente durante 2 h.
  4. Centrifugar a 12.000 x g,30 min, 4 oC, recoger el sobrenadante (es decir, la muestra de proteína mitocondrial extraída) y medir el contenido de proteína con un kit de ensayo de proteína de ácido bicinchíninic (BCA).
  5. Preparar 50 ml de 1,5 M Tris-HCl (pH 8.8) mezclando 9,08 g de Tris y 40 mL de ddH2O, ajustando el pH a 8,8 con HCl y añadiendo ddH2O a un volumen final de 50 ml. Conservar a 4oC.
  6. Preparar 50 ml de 1 M Tris-HCl (pH 6.8) mezclando 6,06 g de Tris y 40 mL de ddH2O, ajustando el pH a 6,8 con HCl y añadiendo ddH2O a un volumen final de 50 ml. Conservar a 4oC.
  7. Preparar 100 ml de solución 30% acrilamida-bis mezclando 29 g de acrilamida, 1 g de bis-acrilamida y 80 ml de ddH2O, y añadiendo ddH2O a un volumen final de 100 ml. Guárdelo en una botella marrón a 4oC.
  8. Preparar 1.000 ml de tampón de electroforesis de trisglicina 10x mezclando 29 g de glicina, 58 g de Tris, 3,7 g de dodecilo sulfato sódico (SDS) y 800 ml de ddH2O, y luego añadiendo ddH2O a un volumen final de 1.000 ml.
  9. Preparar 10 ml de tampón de carga mezclando 2 ml de glicerina, 0,02 g de azul bromofenol, 0,4 g de SDS, 2 ml de Tris-HCl pH 6,8 y 7 ml de ddH2O, y luego añadiendo ddH2O a un volumen final de 10 ml.
  10. Preparar 10 ml de electroforesis de gel de dodecylo sulfato de dodecilo sódico al 10% (SDS-PAGE) mezclando 4 ml de ddH2O, 3,3 ml de 30% de solución de acrilamida-Bis, 2,5 ml de 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 ml de 10% de SDS, 0,1 ml de persulfato de amonio al 10% y 0,004 ml de tetrametiletilendiamina (TEMED). Vierta la solución de gel de resolución SDS-PAGE en la placa entre las placas de vidrio hasta el nivel de la parte inferior del peine. Añadir 2 ml de alcohol isopropílico en la parte superior. Dejar actuar durante 30 minutos.
  11. Retire el alcohol isopropílico y lave la parte superior con ddH2O 3x. Verter la solución de gel de concentración del 5% que contiene 4,1 ml de ddH2O, 1,0 ml de solución de acilamida-bis al 30%, 0,75 ml de 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,06 ml de 10% de SDS, 0,06 ml de persulfato de amonio al 10% y 0,06 mL de TEMED. Inserte inmediatamente el peine en la solución de gel de concentración, deje durante 30 minutos y luego saque el peine.
  12. Prepare el tampón de electroforesis tris-glicina 1x diluyendo 100 ml de tampón de electroforesis Tris-glicina 10x con 900 ml de ddH2O y vierta en el tanque electroforético.
  13. Mezclar 30 g de las proteínas mitocondriales del cáncer de ovario y controlar los tejidos ováricos del paso 3.4 con el tampón de carga para alcanzar un volumen final de 20 l. Hervir la mezcla durante 5 min, luego separarla con el gel de resolución 10% SDS-PAGE utilizando una tensión constante de 100 V. Cuando el azul bromfenol llegue al fondo, detenga la electroforesis.
  14. Preparar 1.5 L de tampón de transferencia electroforética mezclando 150 ml de tampón de electroforesis Tris-glicina 10x, 1.050 ml de ddH2O y 300 ml de metanol.
  15. Remoje la membrana PVDF en 100% metanol durante 10 min y en tampón de transferencia electroforético durante al menos 5 min. Remoje cinco hojas de papel filtrante en 1 tampón de transferencia elecrorórtica durante al menos 5 minutos.
  16. Saque el gel SDS-PAGE que contiene las proteínas y remoje lo en tampón de transferencia electroforético durante 10 minutos.
  17. Haga un cassette de transferencia colocando una esponja húmeda en la placa blanca, tres hojas de papel de filtro húmedo, la membrana PVDF, el gel SDS-PAGE con las proteínas, dos hojas de papel de filtro húmedo y la esponja húmeda de abajo a arriba. Evite las burbujas.
  18. Coloque el cassette de transferencia en el tanque electroforético, vierta en el tampón de transferencia electroforético y, a continuación, transfiera durante 2 h bajo una corriente constante de 200 mA.
  19. Prepare 10x Tris-buffered solución de stock de solución salina (TBS) mezclando 12.114 g de Tris, 29.22 g de NaCl, y agregando ddH2O a un volumen final de 500 mL. Preparar 2 L de 1x TBST mezclando 200 mL de 10x TBS, 2 mL de Tween-20, y 1.798 mL de ddH2O. Preparar 100 mL de solución de bloqueo mezclando 100 mL de TBST y 5 g de BSA.
  20. Después de la transferencia, sacar la membrana PVDF, lavar ligeramente en TBST durante 5 min, luego bloquearlo en solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente.
  21. Incubar la membrana PVDF (4oC durante la noche) con diferentes anticuerpos primarios específicos de diferentes orgánulos subcelulares, incluyendo lamina B (núcleo celular; anticuerpo antihumano de cabra 1: solución de bloqueo de 1.000), flotillina-1 (citomembrana; conejo antihumano anticuerpo 1:500 solución de bloqueo), COX4I1 (mitocondrion; conejo antihumano 1:1,000 solución de bloqueo), GM130 (aparato Golgi; anticuerpo antihumano ratón 1:1,000 solución de bloqueo), catalasa (peroxoma; anticuerpo antihumano conejo 1:1,000 bloqueo de bloqueo 1:1,000 bloqueo de bloqueo solución) y la catepsina B (solución de bloqueo de lisósoma; conejo antihumano 1:1.000). Lavar ligeramente en TBST durante 5 min 3x.
  22. Incubar la membrana PVDF durante 1 h a temperatura ambiente con los anticuerpos secundarios correspondientes (anticabra conejo, cabra anticonejo o antiratón de cabra). Lavar ligeramente en TBST durante 5 min 3x. Visualícelo con electroquimioluminiscencia (ECL).

4. Análisis iTRAQ-SCX-LC-MS/MS

NOTA: Los procedimientos detallados para la sección 4 se refieren a las instrucciones de iTRAQ(Tabla de materiales).

  1. Añadir tampón SDT (4% SDS, 100 mM Tris-HCl pH 7.6 y 100 mM DTT) a las muestras mitocondriales purificadas (es decir, los pellets de los tejidos del cáncer de ovario del paso 1.16 y los tejidos ováricos de control del paso 2.17). Vórtice la muestra hasta que no haya precipitado visible.
    NOTA: La relación de la muestra mitocondrial a la zona de influencia SDT debe ser 1:5.
  2. Hervir la muestra tratada con SDT durante 5 min, enfriar la muestra sobre hielo y luego centrifugar (2.000 x g,2 min).
  3. Recoger el sobrenadante como las muestras de proteína mitocondrial extraídas y medir el contenido de proteína con un kit de ensayo de proteína BCA.
  4. Tome proteínas mitocondriales extraídas de SDT (200 g de cada muestra) para la reducción, alquilación, digestión con trippsina, desalinización y liofilización3,4. Realice tres réplicas para cada muestra.
  5. Tratar los péptidos trípticos (100 g de cada muestra) del paso 4.4 con solución de bromuro de amonio tetraetilo de 100 mM (pH 8.5), y etiquetar los péptidos trípticos con uno de los reactivos iTRAQ de 6 plexigts de acuerdo con sus instrucciones3,4. Etiquete cada muestra 3x.
  6. Mezclar igualmente 6 muestras de péptidos trípticos etiquetados (tres de tejidos de cáncer de ovario y tres de tejidos ováricos de control), y secar con un concentrador de vacío.
  7. Fraccionar los péptidos mixtos etiquetados con iTRAQ con cromatografía SCX en 60 fracciones (una fracción por 1 min), luego combinar cada dos fracciones como una muestra fraccionada SCX (n a 30).
  8. Someta cada muestra fraccionada por SCX al análisis LC-MS/MS en un espectrómetro demasas3,4 junto con un sistema nano LC dentro de un gradiente de separación LC de 60 minutos para obtener datos De MS/MS.
  9. Busque en los datos de MS/MS para identificar proteínas con el motor de búsqueda(Tabla de materiales).
  10. Utilice las intensidades de iTRAQ reporter-ion para cuantificar cada proteína y determinar las proteínas mitocondriales expresadas diferencialmente (mtDEP) con un cambio de >1.5 o <-1.5 veces, y p < 0.05.

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Representative Results

Hubo una diferencia en la preparación de las mitocondrias de los tejidos del cáncer de ovario y el control de los tejidos ováricos. Este estudio encontró que era mucho más fácil preparar las mitocondrias de los tejidos del cáncer de ovario que de los tejidos ováricos de control3,4. Se tuvieron que introducir algunas mejoras en el protocolo para la preparación de las mitocondrias a partir de tejidos ováricos de control. En primer lugar, antes de la homogeneización tisular, era necesario añadir 8 ml de 0,05% de trippsina/20 mM EDTA en la solución de PBS añadida a los tejidos de control picados, seguida de digestión durante 30 minutos a temperatura ambiente, y centrifugación a 200 x g durante 5 min (ver paso de protocolo 2.5). Esto mejoró la preparación de las mitocondrias. En segundo lugar, el gradiente de densidad discontinua fue diferente para la preparación de mitocondrias a partir de tejidos ováricos de control y tejidos de cáncer de ovario(Figura 1). Para los tejidos de cáncer de ovario se preparó añadiendo 5 ml de 34%, 8 ml de 30%, 12 ml de 25% (que contiene las mitocondrias brutas), 8 ml de 23%, y 3 ml de medio gradiente de densidad del 20% de abajo a arriba en un tubo. Las mitocondrias purificadas se encontraron en la interfaz entre 25% y 30% después de la centrifugación(Figura 1A,ver pasos de protocolo 1.12 y 1.13). Para controlar los tejidos ováricos se preparó añadiendo 8 ml de 38%, 5 ml de 34%, 8 ml de 30%, 12 ml de 25% (que contiene la mitocondria bruta), 8 ml de 23%, y 3 ml de medio gradiente de densidad del 20% de abajo a arriba en un tubo. En este caso, las mitocondrias purificadas estaban en el rango de la interfaz entre 25% y 30% a la interfaz entre 34% y 38% después de la centrifugación(Figura 1B,ver los pasos de protocolo 2.13 y 2.14).

El protocolo obtuvo muestras mitocondriales de alta calidad. Las muestras mitocondriales de alta calidad son el requisito previo para la proteómica mitocondrial cuantitativa. Este estudio evaluó la calidad de las mitocondrias que se prepararon con centrifugación de velocidad diferencial y centrifugación de gradiente de densidad a través de EM(Figura 2)y Western blot (WB, Figura 3). Las imágenes EM demostraron que tanto en los cánceres de ovario como en los tejidos ováricos de control, los principales orgánulos aislados eran las mitocondrias, excepto por una pequeña cantidad de peroxinomas. La morfología de las mitocondrias cambió más en los cánceres de ovario que en el control del tejido ovárico(Figura 2). Las imágenes del BM demostraron que el componente principal en las muestras mitocondriales preparadas de cánceres de ovario y ovarios de control era las mitocondrias, excepto por una pequeña cantidad de peroxinosos(Figura 3). Los resultados del BM fueron coherentes con los resultados de la EM. Era razonable que los peroxisomas se contuvieran en las mitocondrias preparadas, porque las mitocondrias interactúan ampliamente conlosperoxisomas3,17,18,que a su vez reflejan la integridad funcional de las mitocondrias. Estos resultados demostraron la alta calidad de las muestras mitocondriales preparadas.

La cantidad de proteína mitocondrial preparada con este protocolo fue adecuada para su posterior análisis. Es necesario obtener una cantidad suficiente de muestras mitocondriales de cáncer de ovario y controlar los tejidos ováricos. Este estudio combinó las muestras mitocondriales preparadas a partir de siete tejidos de cáncer de ovario, y de 11 tejidos ováricos de control3. Se obtuvieron un total de 2.409 g de muestra de proteína mitocondrial para los cánceres de ovario, y 4.440 g de muestra de proteína mitocondrial para el tejido ovárico de control(Tabla 1). Por lo general, para la proteómica cuantitativa iTRAQ, cada muestra necesita al menos 600 g de proteínas (200 g de proteínas por cada etiquetado iTRAQ, 3 réplicas). Por lo tanto, las muestras de proteína mitocondrial preparadas fueron suficientes para el análisis proteómico cuantitativo de iTRAQ.

El logro del número máximo de proteínas cuantificadas beneficia la investigación en profundidad de las mitocondrias en el cáncer de ovario humano. Este estudio detectó, identificó y cuantificó 5.115 proteínas en cánceres de ovario en comparación con el control del tejido ovárico, incluyendo 2.565 (50,14%) proteínas reguladas (relación de los cánceres a los controles >1) y 2.550 (49,86%) proteínas reguladas (relación de los cánceres a los controles <1)3 (Tabla 2). Además, este estudio determinó 1.198 mtDE entre cánceres de ovario y controlar los ovarios con >1,5 o <-1,5 cambios de pliegue (p < 0,05), incluyendo 523 (43,66%) proteínas reguladas y 675 (56,34%) proteínas reguladas4 (Tabla 2). Estos datos son actualmente el mayor perfil de proteome mitocondrial en cáncer de ovario.

Figure 1
Figura 1: Las mitocondrias brutas fueron purificadas con centrifugación de gradiente de densidad discontinua para cáncer de ovario (A) y control de tejidos ováricos(B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagen micrográfica electrónica de mitocondrias aisladas del cáncer de ovario (A) y control de tejidos ováricos (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Imágenes de manchas occidentales basadas en anticuerpos específicos de Organelle de mitocondrias aisladas del cáncer de ovario (A) y de control de tejidos de ovario(B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Muestra de proteína mitocondrial Volumen (L) Concentración (g/L) Proteínas (g)
Tejido de cáncer de ovario 530 4.545 2,409
Controlar el tejido ovárico 750 5.92 4,440

Tabla 1: La cantidad de muestras de proteína mitocondrial preparadas.

Categoría El número total de proteínas* El número de proteínas expresadas diferencialmente?
Regulación ascendente 2,565 (50.14%) 523 (43.66%)
Regulación descendente 2,550 (49.86%) 675 (56.34%)
Total 5,115 (100.0%) 1,198 (100.0%)
*La proporción de cánceres a los controles es >1 para la regulación ascendente, <1 para la regulación descendente.
# La proporción de cánceres a los controles es >1.5 veces para la regulación ascendente, y <-1.5 veces para la regulación hacia abajo.

Tabla 2: El número de proteínas identificadas por iTRAQ a partir de muestras mitocondriales preparadas.

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Discussion

Las alteraciones mitocondriales son un sello distintivo del cáncer de ovario. La preparación de muestras mitocondriales de alta calidad a partir de cáncer de ovario humano y tejidos de control para la proteómica cuantitativa a gran escala benefician la comprensión en profundidad de la función mitocondrial en la patogénesis del cáncer de ovario y los cambios en la red molecular mitocondrial, y ayudan a aclarar su mecanismo molecular para el posterior descubrimiento de la terapia diana y biomarcadores eficaces basados en mitocondrias4,5,8. La centrifugación de velocidad diferencial en combinación con centrifugación de gradiente de densidad efectivamente aislada y purificada mitocondrias de cáncer de ovario humano y control de los tejidos ováricos. Las muestras mitocondriales preparadas eran de muy alta calidad y eran adecuadas para un mayor análisis proteómico cuantitativo.

Las muestras mitocondriales preparadas contenían una pequeña cantidad de peroxisomas3,17,18 y proteínas citosólicas19,20. Esto no debe considerarse simplemente contaminación, ya que directa o indirectamente interactúan o se adhieren con las mitocondrias para permitir que las mitocondrias funcionen más completamente. Los estudios han encontrado que las mitocondrias interactúan ampliamente con el citoesqueleto de actina19,20 y peroxisomas17,18. Es inevitable que algunas proteínas citosólicas y proteínas peroxisomas se contengan en muestras mitocondriales aisladas.

La técnica clave para detectar, identificar y cuantificar proteínas de las muestras mitocondriales preparadas fue el etiquetado iTRAQ-SCX-LC-MS/MS. Este estudio identificó y cuantificó 5.115 proteínas mitocondriales3, incluyendo 1.198 mtDEPs4,14. El gran número de proteínas mitocondriales que se encuentran en los tejidos del cáncer de ovario incluye las que pueden ayudar a entender el papel de las mitocondrias en la patogénesis del cáncer de ovario y también ser un recurso para el descubrimiento de la terapia diana personalizada basada en el metabolismo mitocondrial8,e incluso encontrar biomarcadores eficaces basados en la genómica mitocondrial, proteómica, y metabolómica desde un ángulo multiómico sistemático9,11,12,13. Además, con la introducción de conceptos de especies proteoformes y proteicas en el proteome, la exploración en profundidad de proteoformas mitocondriales o especies de proteínas podría conducir directamente al descubrimiento de biomarcadores eficaces y fiables y dianas terapéuticas para el cáncer de ovario10,21,22.

Además, los protocolos actuales en el análisis de los proteomas mitocondriales del tejido de cáncer de ovario humano descritos aquí se traducen fácilmente para estudiar otros proteomas mitocondriales de enfermedades humanas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Hunan Provincial Hundred Talent Plan (a X.Z.), los Fondos del Hospital Xiangya para la Introducción al Talento (a XZ), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 81572278 y 81272798 a XZ), las subvenciones de China "863" Plan Plan (Concesión No 2014AA020610-1 a XZ), y la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Hunan de China (Subvención No 14JJ7008 a XZ). X.Z. concibió el concepto para el presente manuscrito, obtuvo los datos proteómicos cuantitativos iTRAQ de muestras de mitocondrias, escribió y revisó el manuscrito, coordinó el trabajo pertinente y fue responsable del apoyo financiero y el correspondiente Trabajo. Muestras de mitocondrias preparadas por H.L. S.Q. participó en trabajos parciales. X.H.Z participó en la escritura y editó el idioma inglés. N.L. analizó los datos de proteómica iTRAQ. Todos los autores aprobaron el manuscrito final.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCA protein assay kit Vazyme E112 BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml).
Bovine serum albumin (BSA) Solarbio A8020-5G Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98%
Centrifuge XiangYi TDZ4--WS
CHAPS Sigma C9426-5G BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich)
Diamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma 798681-100G Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98%
DTT Sigma 10197777001 1,4-Dithiothreitol
Easy nLC Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific)
Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) Sigma E0396-10G BioXtra, ≥97 .0%
Homogenizer SilentShake HYQ-3110
iTRAQ reagent kit Applied Biosystems Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A
Low-temperature super-speed centrifuger Eppendorf 5424R
Mannitol Macklin M813424-100G Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency.
MASCOT search engine Matrix Science, London, UK; version 2.2
Nagarse Solarbio P9090
N-hydroxysuccinimide (SDT) Sigma 56480-25G Purum, ≥97.0% (T)
Nycodenz Alere/Axis-Shield 1002424-1
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor Solarbio P0100-1ML PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain.
Potassium chloride Macklin P816354-25G Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute.
Proteome Discover 1.4 Matrix Science, London, UK
PVDF membrane Millipore 05317 It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes.
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher Scientific
SCX column Sigma 58997 It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco).
Sodium orthovanadate (V) Macklin S817660-25G Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution.
Sucrose Macklin S824459-500G Vetec reagent grade, 99%
Thiourea Sigma 62-56-6 ACS reagent, ≥99.0%
Tris base Sigma 10708976001 TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C.
Trypsin (cell culture use) Gibco 25200-056 This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation.
Urea Sigma U5378-100G powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture

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References

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Cancer Research Número 153 cáncer de ovario mitocondrias centrifugación de velocidad diferencial centrifugación de gradiente de densidad etiqueta isobárica para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) etiquetado intercambio de cationes fuerte (SCX) cromatografía líquida (LC) espectrometría de masas en tándem (MS/MS) proteome
Preparación de Mitocondrias a partir de tejidos de cáncer de ovario y tejidos ováricos de control para el análisis proteómico cuantitativo
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Zhan, X., Li, H., Qian, S., Zhan, X., Li, N. Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis. J. Vis. Exp. (153), e60435, doi:10.3791/60435 (2019).

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