קוונפיקציה של מתרבים ותאים מתים ב Enteroids
Summary
הפרוטוקול המוצג משתמש cy, לנסות לכמת את מספר התאים מתרבים ומתים בתוך העכבר התרבותי enteroids. שיטה זו שימושית להערכת ההשפעות של טיפול תרופתי בשגשוג והישרדות של אורגנואיד.
Abstract
אפיתל המעי משמש מחסום המונע תוכן הלומיאלי, כגון מיקרוביוטה פתוגניים ורעלים, מלהיכנס לשאר הגוף. תפקוד המכשול אפיתל דורש שלמות של תאים אפיתל המעי. בעוד התפשטות התא אפיתל שומרת על שכבה רציפה של תאים המהווה מחסום, נזק אפיתל מוביל לתפקוד המכשול. כתוצאה מכך, תוכן הלומיאל יכול לחצות את מחסום המעי דרך מסלול בלתי מוגבל. התפקוד של מחסום המעיים נקשר למחלות מעיים רבות, כגון מחלות מעי דלקתיות. מבודד עכבר מעיים קריפטים יכול להיות תרבותי ומתוחזק כמו קריפטה-villus מבנים כמו, אשר מכונים אורגנואידים מעיים או “enteroids”. בידור הם אידיאליים ללמוד את התפשטות ומוות התאים של תאי אפיתל המעי בתוך מבחנה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לכמת את מספר התאים המתרבים והמתים בידור תרבותי. 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) ו propidium יודיד משמשים לתווית תאים מתרבים ומתים ב-enteroids, ושיעור של תאים מתרבים ומתים מנותח לאחר מכן על ידי מנתחים cy, לנסות. זהו כלי שימושי כדי לבדוק את ההשפעות של טיפול תרופתי על התפשטות תא אפיתל המעי הישרדות התא.
Introduction
פונקציה יסודית של תאים אפיתל המעי היא להגן על כניסת תוכן הלומיאל כגון חיידקים פתוגניים ורעלים1,2. כדי לבצע פונקציה כזו, תאי גזע המעיים ברציפות מתרבים ולהבדיל למגוון של תאים אפיתל, כולל בידור תאים הפרשה, אשר יוצרים מכשול על ידי יצירת קשרים הדוקים3. התחדשות מהירה של תאים אפיתל המעי דורש תיאום מחמיר של התפשטות התא, בידול התא, ואת המוות התאים4,5. הפצת תאים מופחתת או מוות מופרז של תאים מוביל נזק אפיתל ופגיעה בתפקוד המכשול1,6. תפקוד של מכשול המעיים שויך מחלות מעיים דלקתיות7,8.
שיטה לקריפטטים מעיים תרבותי פותחה בעבר. באמצעות טכניקה זו, עכבר מבודד קריפטים לגדול לתוך מעיים אורגנואידים (enteroids), אשר יש קריפטה-villus כמו מבנים ומכילים את כל השושלת האפיתל המעי תא9,10. 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) הוא אנלוגי תימידין כי הוא מסוגל להחליף תימין (T) ב-DNA כי עובר שכפול במהלך הפצת תאים. התאים הניתנים להתרבות יכולים להיות מסומנים במהירות ובדייקנות על-ידי EdU מכתים. Propidium יודיד (PI) הוא אנלוגי של אתידיום ברומיד המשחרר את הזריחה האדומה בעת הכניסה לתוך ה-DNA התקוע כפול. PI מזהה באופן ספציפי תאים מתים, שכן הוא עובר רק דרך קרום התא ניזוק.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים תחילה כיצד לבודד קריפטטים מן המעי הקטן מורטין ואז לתרבות אותם כמו בידור בתוך מבחנה. לאחר מכן נתאר כיצד לנתח את התאים המתרבים והמתים ב-enteroids על ידי EdU ו-PI התאגדות וזרימה cy, לנסות.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מפרט את הצעדים הנחוצים לתרבות של בידור באמצעות מבחנה וכימות של תאים של EdU ו-PI-חיוביים ב-enteroids על ידי הזרמת cy, try. יש מספר יתרונות של אסטרטגיה זו. ראשית, התוויות של EdU משמשות לזיהוי תאים מתרבים ב-enteroids. בהשוואה לשיטת BrdU המסורתית, שיטת התיוג של EdU היא מהירה יותר, רגישה יותר ומדויקת יותר….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31971062, 31900326, ו 31601022), הקרן המדע הטבעי של מחוז ג’יאנגסו (BK20190043, BK20180838), קרן מחקר של המעבדה מפתח המדינה של ביוטכנולוגיה התרופות, אוניברסיטת נאנג’ינג (KF-GN-202004). הקרן המדע הטבעי של ג’יאנגסו מוסדות ההשכלה הגבוהה של סין (19KJB320003), תוכנית פרנסה וטכנולוגיה של סאזהאו City (SYS2019030), ואת תוכנית חדשנות מחקר עבור בוגרי המכללה של מחוז ג’יאנגסו (KYCX19-1981) . עבודה זו נתמכת גם על ידי טאנג המלומד של אוניברסיטת Soochow.
Materials
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).
- Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
- Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
- Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).
