Количественная оценка пролиферативной и мертвой клетки в Enteroids
Summary
Представленный протокол использует цитометрию потока для количественной оценки количества размножающихся и мертвых клеток в культивированных вратах мыши. Этот метод полезен для оценки влияния медикаментозного лечения на пролиферацию и выживание органов.
Abstract
Кишечный эпителий действует как барьер, который предотвращает проникновение в остальную часть тела содержимого светила, например патогенной микробиоты и токсинов. Функция эпителиального барьера требует целостности кишечных эпителиальных клеток. В то время как эпителиальная пролиферация клеток поддерживает непрерывный слой клеток, который образует барьер, эпителиальный ущерб приводит к барьерной дисфункции. В результате содержимое светильника может пересекать кишечный барьер неограниченным путем. Дисфункция кишечного барьера была связана со многими кишечными заболеваниями, такими как воспалительные заболевания кишечника. Изолированные мыши кишечные склепы могут быть культивированы и поддерживается как склеповидные структуры, которые называются кишечными органоидами или “энтероидами”. Энтероиды идеально подходят для изучения пролиферации и клеточной смерти кишечных эпителиальных клеток in vitro. В этом протоколе мы описываем простой метод количественной оценки количества размножающихся и мертвых клеток в культивированных энтероидах. 5-этинил-2′-deoxyuridine (EdU) и пропидий йодид используются для обозначения размножающихся и мертвых клеток в энтероидах, а доля размножающихся и мертвых клеток затем анализируется цитометрией потока. Это полезный инструмент для проверки влияния медикаментозного лечения на пролиферацию эпителиальных клеток кишечника и выживание клеток.
Introduction
Фундаментальная функция кишечных эпителиальных клеток заключается в защите попадания содержимого светила, таких как патогенные бактерии и токсины1,2. Для выполнения такой функции, кишечные стволовые клетки непрерывно размножаться и дифференцироваться в различные эпителиальные клетки, в том числе энтероцитов и секреторных клеток, которые образуют барьер, образуя тесные соединения3. Быстрое обновление кишечных эпителиальных клеток требует строгой координации пролиферации клеток, дифференциации клеток и гибели клеток4,5. Снижение пролиферации клеток или чрезмерная гибель клеток приводит к эпителиальному повреждению и скомпрометированной функциибарьера1,6. Дисфункция кишечного барьера была связана с воспалительными заболеваниями кишечника7,8.
Ранее был разработан метод культуры кишечных склепов. Используя этот метод, изолированные мыши ные склепы растут в кишечные органоиды (enteroids), которые имеют crypt-villus как структуры и содержат все кишечной эпителиальной линии клеток9,10. 5-этинил-2′-deoxyuridine (EdU) является аналогом тимидина, который способен заменить тимин (T) в ДНК, которая проходит репликацию во время пролиферации клеток. Пролиферативные клетки могут быть быстро и точно помечены EdU окрашивания. Propidium iodide (PI) является аналогом бромида этидия, который высвобождает красную флуоресценцию при вставке в двухцепочечную ДНК. PI специально обнаруживает мертвые клетки, так как он проходит только через поврежденную мембрану клетки.
В этом протоколе мы сначала описываем, как изолировать склепы из тонкой кишки, а затем культивировать их как ветероиды in vitro. Затем мы описываем, как анализировать пролиферативные и мертвые клетки в enteroids EdU и PI включения и потока цитометрии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол детализирует шаги, необходимые для культуры enteroids in vitro и количественной оценки EdU- и PI-положительных клеток в enteroids цитометрией потока. Есть несколько преимуществ этой стратегии. Во-первых, маркировка EdU используется для обнаружения размножающихся клеток в ветроидающих. П?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается Национальным фондом естественных наук Китая (31971062, 31900326 и 31601022), Фондом естественных наук провинции Цзянсу (BK20190043, BK20180838), Научно-исследовательским фондом Государственной ключевой лаборатории фармацевтической биотехнологии, Нанкинский университет (KF-GN-202004). Фонд естественных наук высших учебных заведений Китая Цзянсу (19KJB320003), программа обеспечения жизни и технологии города Сучжоу (SYS2019030) и Программа научно-исследовательской инновационной программы для выпускников колледжей провинции Цзянсу (KYCX19-1981) . Эта работа также поддерживается Тан ученый Университета Soochow.
Materials
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).
- Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
- Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
- Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).
