Summary

腸内細胞増殖細胞および死細胞の定量化

Published: January 31, 2020
doi:

Summary

提示されたプロトコルは、フローサイトメトリーを使用して、培養マウスエンターイドにおける増殖細胞および死細胞の数を定量化する。この方法は、オルガノイドの増殖および生存に対する薬物治療の効果を評価するのに役立つ。

Abstract

腸上皮は、病原性微生物叢や毒素などの発光内容物が身体の残りの部分に入るのを防ぐ障壁として機能する。上皮バリア機能は、腸上皮細胞の完全性を必要とする。上皮細胞の増殖はバリアを形成する細胞の連続層を維持する一方で、上皮損傷はバリア機能障害を引き起こす。その結果、明るい内容物は、制限のない経路を介して腸の障壁を越えることができます。腸内バリアの機能不全は、炎症性腸疾患などの多くの腸疾患に関連している。単離されたマウス腸管は、腸オルガノイドまたは「腸内ロイド」と呼ばれるクリプト・ビラス様構造として培養および維持することができる。腸内ロイドは、腸管上皮細胞の増殖および細胞死をインビトロで研究するのに理想的である。このプロトコルでは、培養エンテロイド中の増殖細胞および死細胞数を定量化する簡単な方法を説明する。5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)およびヨウ化プロピジウムは、腸内の増殖および死細胞の標識に使用され、増殖および死細胞の割合は、フローサイトメトリーによって分析される。これは、腸上皮細胞増殖および細胞生存に対する薬物治療の効果を試験するのに有用なツールである。

Introduction

腸管上皮細胞の基本的な機能は、病原性細菌および毒素1、2などの発光内容物の侵入を保護することです。このような機能を果たすために、腸幹細胞は、腸球細胞や分泌細胞を含む様々な上皮細胞に増殖し、かつ分化し、密閉結合を形成して障壁を形成する3。腸管上皮細胞の急速な再生は、細胞増殖、細胞分化、および細胞死4、5の厳密な調整を必要とする。細胞増殖の減少または過剰な細胞死は、上皮損傷および障壁機能1、6の侵害につながる。腸内バリアの機能不全は炎症性腸疾患7,8に関連付けられている。

腸管の納骨堂を培養する方法が以前に開発されている。この技術を用いて、単離されたマウスの陰窩は腸オルガノイド(腸内ロイド)に成長し、構造のような陰窩を有し、全ての腸上皮細胞系統9、10を含有する。5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)は、細胞増殖中に複製を受けているDNA中のチミン(T)を置換することができるチミジンアナログである。増殖性細胞は、EdU染色により迅速かつ正確に標識することができる。ヨウ化プロピジウム(PI)は、二本鎖DNAへの挿入時に赤色蛍光を放出する臭化エチジウムの類似体である。PIは、損傷した細胞膜を通過するだけなので、特に死細胞を検出する。

このプロトコルでは、まず、マウス小腸から被検査を分離し、それを腸内で腸状として培養する方法を説明する。次に、EdUおよびPIの組み込みおよびフローサイトメトリーによる腸内の増殖細胞および死細胞の分析方法を説明する。

Protocol

このプロトコルは、ケンブリッジ・スーダゲノムリソースセンター(CAM-SU)の動物ケアと使用委員会によって承認されました。 1. 腸内オルガノイドの分離と文化 腸管の分離と腸内の文化 CO2吸入で8週齢の野生型マウスを安楽死させる。約8cmの回腸を解剖するために、ティッシュ鉗子と細かい虹彩ハサミを使用してください。 氷冷ダルベッコの?…

Representative Results

小腸のクリプトは、基細胞膜マトリックス中の腸ロイドとして単離し、培養した。エンターイドは、分離の2日後に芽を形成し始めました。6日目、腸内ロイドは、内腔に多くの破片(死細胞)を持つ多くの芽を持っていました。この段階で腸ロイドは継代を行う準備ができていました(図3)。 多くの研究は、炎症性サイトカインが腸上皮性恒常性の維持?…

Discussion

このプロトコルは、インビトロで腸内の腸イトの培養に必要なステップを詳述し、腸内のEdU-およびPI陽性細胞をフローサイトメトリーで定量する。この戦略には、いくつかの利点があります。まず、EdU ラベリングは、腸内の増殖細胞を検出するために使用されます。従来のBrdUアッセイと比較して、EdUラベリング法はより速く、より敏感で、より正確である。EdUはチミン(T)と非常によく似て?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国国立自然科学財団(31971062、31900326、31600322)、江蘇省自然科学財団(BK20190043、BK20180838)、医薬品バイオテクノロジーの国家主要研究所の研究基金、中国の国家自然科学財団によって支援されています。南京大学(KF-GN-202004)。中国江蘇高等教育機関の自然科学財団(19KJB320003)、蘇州市の生計と技術プログラム(SYS2019030)、江蘇省大学卒業生研究イノベーションプログラム(KYCX19-1981).この作品は、スーチョウ大学の唐学者によってもサポートされています。

Materials

15 ml centrifuge tube Corning 430791
22 G gavage needle VWR 20068-608
24-well plate Nunc 142475
40 mm sterile cell strainer BD 352340
50 ml centrifuge tube Corning 430829
70 mm sterile cell strainer BD 352350
Advanced DMEM/F-12 GIBCO 12634010
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer Invitrogen A24863
B-27 Supplement GIBCO 17504044
Buffer 1 2 mM EDTA in DPBS
Buffer 2 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS
C57/B6 mice Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University
Cell-dissociation enzymes (TrypLE) Life technologies 12605-010
Centrifuge Eppendorf 5424
Centrifuge Eppendorf 5424R
Centrifuge Eppendorf 5810R
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Life technologies C10639
CO2 incubator Panasonic MCO-18AC
DPBS GIBCO 14190144
D-sorbitol BBI SB0491
EDTA BBI EB0185
ENR media Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270-106
Fine Iris Scissors Tansoole 2037454
Fluorescence microscope Olympus FV1000
GlutaMAX Supplement GIBCO 35050-061
Goat Serum Life technologies 16210-064
HDMEM Hyclone SH30243.01B
HEPES Sigma H4034
Matrigel Corning 356231
Minigut media Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)
N2 supplement R&D AR009
Nonionic surfactant (Triton X) BBI TB0198-500ML
Operating Scissor (12.5 cm) Tansoole 2025785
Paraformaldehyde (PFA) sigma 158127-500g
Penn/Strep Invitrogen 15140-148
Phase contrast microscope Nikon TS1000
Propidium iodide Sigma P4170-25MG
Recombinant EGF PeproTech 315-09
Recombinant Mouse Noggin PeproTech 250-38
Recombinant Mouse R-Spondin 1 R&D 3474-RS-050
Recombinant Murine IL-22 PeproTech 210-22-10
Sucrose BBI SB0498
Tissue Forceps Tansoole 2026704
Y-27632 2HC1 Selleck S1049

References

  1. Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
  2. Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
  3. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
  4. Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
  5. Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).
  6. Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
  7. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
  8. Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
  9. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  10. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  11. Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
  12. Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).
check_url/60501?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Li, H., Xu, S., Sheng, J., Jiang, Z., Wang, J., Ding, N., Wang, T., Odenwald, M. A., Turner, J. R., He, W., Xu, H., Zha, J. Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids. J. Vis. Exp. (155), e60501, doi:10.3791/60501 (2020).

View Video