Kvantificering af proliferative og døde celler i Enteroids
Summary
Den præsenterede protokol bruger flow cytometri til at kvantificere antallet af prolifererende og døde celler i dyrkede mus enteroids. Denne metode er nyttig til at vurdere virkningerne af narkotikabehandling på organoid spredning og overlevelse.
Abstract
Tarmepitel fungerer som en barriere, der forhindrer luminal indhold, såsom patogene mikrobiota og toksiner, i at komme ind i resten af kroppen. Epitelbarrierefunktion kræver integriteten af epitelceller i tarmen. Mens epitelcelleproliferation opretholder et kontinuerligt lag af celler, der danner en barriere, fører epitelskader til barrieredysfunktion. Som et resultat, luminal indhold kan på tværs af tarmbarrieren via en ubegrænset vej. Dysfunktion af tarmbarriere har været forbundet med mange tarmsygdomme, såsom inflammatorisk tarmsygdom. Isolerede mus tarm krypter kan dyrkes og vedligeholdes som krypt-villus-lignende strukturer, som kaldes tarm organoids eller “enteroids”. Enteroids er ideelle til at studere spredning og celledød af tarm epitelceller in vitro. I denne protokol beskriver vi en simpel metode til at kvantificere antallet af proliferative og døde celler i dyrkede enteroids. 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU) og propidiumodid bruges til at mærke proliferating og døde celler i enteroids, og andelen af prolifererende og døde celler analyseres derefter ved flow cytometri. Dette er et nyttigt værktøj til at teste virkningerne af narkotikabehandling på intestinal epitelcelleproliferation og celleoverlevelse.
Introduction
En grundlæggende funktion af tarmepitelceller er at beskytte indførsevnen af luminale indhold såsom patogene bakterier og toksiner1,2. For at udføre en sådan funktion, tarm stamceller løbende formere sig og differentiere ind i en række epitelceller, herunder enterocytter og sekretoriske celler, som danner en barriere ved at danne stramme forbindelser3. Den hurtige fornyelse af tarmepitelceller kræver streng koordinering af cellespredning, celledifferentiering og celledød4,5. Reduceret cellespredning eller overdreven celledød fører til epitelskader og kompromitteret barrierefunktion1,6. Dysfunktion af tarmbarriere har været forbundet med inflammatoriske tarmsygdomme7,8.
En metode til at kultur tarm krypter er tidligere blevet udviklet. Ved hjælp af denne teknik, isolerede musekrypter vokse ind i intestinal organoids (enteroids), som har krypt-villus lignende strukturer og indeholder alle intestinale epitelcelle afstamning9,10. 5-Ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU) er en thymidin analog, der er i stand til at erstatte thymin (T) i DNA, der er ved at blive replikeret under celleproliferation. De proliferative celler kan hurtigt og præcist mærket af EdU farvning. Propidiumiodid (PI) er en analog af ethidiumbromid, der frigiver rød fluorescens ved indsættelse i dobbeltstrenget DNA. PI registrerer specifikt døde celler, da den kun passerer gennem den beskadigede cellemembran.
I denne protokol beskriver vi først, hvordan man isolerer krypter fra murine tyndtarmen og derefter kultur dem som enteroids in vitro. Vi beskriver derefter, hvordan man analyserer de proliferative og døde celler i enteroids af EdU og PI inkorporering og flow cytometri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver de trin, der er nødvendige for kulturen i enteroids in vitro og kvantificering af EdU- og PI-positive celler i enteroids ved flow cytometri. Der er flere fordele ved denne strategi. For det første anvendes EdU-mærkning til at detektere spredningsceller i enteroider. Sammenlignet med traditionel BrdU-analyse er EdU-mærkningsmetoden hurtigere, mere følsom og mere præcis. EdU er meget lig thymin (T), som erstatter thymin i DNA-syntese under celledeling. Sammenlignet med BrdU antistof, EdU er l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde støttes af The National Natural Science Foundation of China (31971062, 31900326 og 31601022), The Natural Science Foundation of Jiangsu-provinsen (BK20190043, BK20180838), Forskningsfond for statens nøglelaboratorium for farmaceutisk bioteknologi, Nanjing Universitet (KF-GN-202004). The Natural Science Foundation af Jiangsu videregående uddannelsesinstitutioner i Kina (19KJB320003), Levebrød og Teknologi Program af Suzhou City (SYS2019030), og The Research Innovation Program for College Kandidater i Jiangsu-provinsen (KYCX19-1981) . Dette arbejde er også støttet af Tang Scholar fra Soochow University.
Materials
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).
- Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
- Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
- Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).
