Kvantifisering av proliferative og døde celler i enteroider
Summary
Den presenterte protokollen bruker flyt cytometri for å kvantifisere antall spre og døde celler i kultiverte mus enteroider. Denne metoden er nyttig for å evaluere effekten av medikamentell behandling på organoid spredning og overlevelse.
Abstract
Tarmepitelet fungerer som en barriere som forhindrer luminalt innhold, som patogen mikrobiota og toksiner, fra å komme inn i resten av kroppen. Epitelbarrierefunksjon krever integriteten til intestinale epitelceller. Mens epitelcellespredning opprettholder et kontinuerlig lag med celler som danner en barriere, fører epitelskade til barrieredysfunksjon. Som et resultat kan luminalt innhold over tarmbarrieren via en ubegrenset vei. Dysfunksjon av tarmbarrieren har vært forbundet med mange tarmsykdommer, som inflammatorisk tarmsykdom. Isolerte musetarmkrypter kan dyrkes og opprettholdes som krypt-villus-lignende strukturer, som kalles tarmorganoider eller “enteroider”. Enteroider er ideelle for å studere spredning og celledød av intestinal epitetialceller in vitro. I denne protokollen beskriver vi en enkel metode for å kvantifisere antall proliferative og døde celler i kultiverte enteroider. 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) og propidium jodid brukes til å merke prolifererende og døde celler i enteroider, og andelen av prolifererende og døde celler analyseres deretter ved flyt cytometri. Dette er et nyttig verktøy for å teste effekten av legemiddelbehandling på intestinal epitelcellespredning og celleoverlevelse.
Introduction
En grunnleggende funksjon av intestinal epitetialceller er å beskytte oppføring av luminal innhold som patogene bakterier og giftstoffer1,2. For å utføre en slik funksjon sprer tarmstamceller kontinuerlig og differensierer seg til en rekke epitelceller, inkludert enterocytter og sekretoriske celler, som danner en barriere ved å danne stramme forbindelser3. Den raske fornyelsen av intestinale epitelceller krever streng koordinering av cellespredning, celledifferensiering og celledød4,5. Redusert cellespredning eller overdreven celledød fører til epitelskade og kompromittert barrierefunksjon1,6. Dysfunksjon av tarmbarrieren har vært forbundet med inflammatoriske tarmsykdommer7,8.
En metode for å kultur tarm krypter har tidligere blitt utviklet. Ved hjelp av denne teknikken vokser isolerte musekrypter til tarmorganoider (enteroider), som har krypt-villus som strukturer og inneholder alle intestinal epitetial celle avstamning9,10. 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) er en tymidin analog som er i stand til å erstatte dinmin (T) i DNA som gjennomgår replikering under cellespredning. De proliferative cellene kan raskt og nøyaktig merkes av EdU-farging. Propidium jodid (PI) er en analog av ethidium bromid som frigjør rød fluorescens ved innsetting i dobbelt-strandet DNA. PI oppdager spesifikt døde celler, siden den bare passerer gjennom den skadede cellemembranen.
I denne protokollen beskriver vi først hvordan man isolerer krypter fra murine tynntarmen og deretter kultur dem som enteroider in vitro. Vi beskriver deretter hvordan du analyserer de proliferative og døde cellene i enteroider av EdU og PI inkorporering og flyt cytometri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver trinnene som er nødvendige for kulturen av enteroider in vitro og kvantifisering av EdU- og PI-positive celler i enteroider ved flyt cytometri. Det er flere fordeler med denne strategien. Først brukes EdU-merking til å oppdage prolifererende celler i enteroider. Sammenlignet med tradisjonell BrdU-analyse er EdU-merkingsmetoden raskere, mer følsom og mer nøyaktig. EdU er svært lik thymine (T), som erstatter dinin i DNA-syntese under celledeling. Sammenlignet med BrdU antistoff, Er EdU let…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet støttes av The National Natural Science Foundation of China (31971062, 31900326 og 31601022), The Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190043, BK20180838), Research Fund of State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Nanjing Universitet (KF-GN-202004). Natural Science Foundation av Jiangsu Higher Education Institutions of China (19KJB320003), Levebrød og teknologi program av Suzhou City (SYS2019030), og The Research Innovation Program for College Graduates of Jiangsu-provinsen (KYCX19-1981) . Dette arbeidet støttes også av Tang Scholar of Soochow University.
Materials
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).
- Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
- Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
- Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).
