تسرب الكريات البيض من العضلات الكريماستر في الفئران التي تم تقييمها من قبل المجهر Intravital
Summary
هنا، نعرض كيفية إجراء المجهر intravital على الأفير ما بعد الشعرية من العضلات كريسماستر الماوس. تطبق عادة على نماذج مختلفة من الالتهاب والإنتان، وخاصة تلك الناجمة عن chemokines والسيتوكينيات، ونحن تسليط الضوء على أهميتها في دراسة الموسكولوباثالتي التي تنطوي على تسرب الكريات البيض العضلي مبالغ فيها.
Abstract
يستخدم المجهر اللاحيفي (IVM) على نطاق واسع لمراقبة العمليات الفسيولوجية والفسيولوجية المرضية داخل سلسلة توظيف الكريات البيض في الجسم الحي. يمثل البروتوكول الحالي طريقة عملية وقابلة للاستنساخ لتصور تفاعل البطانة البيض الكريات البيض مما يؤدي إلى تجنيد الكريات البيض في الأنسجة المشتقة من العضلات الهيكلية داخل الكائن السليم للفأرة. النموذج ينطبق على جميع مجالات البحوث التي تركز على تنشيط الحبيبية ودورها في المرض.
نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لتوجيه من خلال الأسلوب وتسليط الضوء على المزالق المحتملة والصعوبات التقنية. يغطي البروتوكول الجوانب التالية: الإعدادات التجريبية والمواد المطلوبة ، وتخدير الماوس ، وتشريح عضلة cremaster وكذلك القصبة الهوائية والإزالة السباتية ، وتسجيلات IVM والتحليل غير المتصل بالإنترنت. يتم شرح تنسيقات البيانات مثل الكريات البيض الملتصقة ، وتدفق المتداول (RF) وكسر التدفق المتداول (RFF) بالتفصيل ويتم مناقشة التطبيقات المناسبة. يتم توفير النتائج التمثيلية من الفئران mdx mdx dystrophin ناقص في قسم النتائج.
IVM هو أداة قوية لتقييم تجنيد الكريات البيض في وضع في الجسم الحي; ومع ذلك، قد يتطلب تحديد على سبيل المثال وظيفة الانبوثيوليال والكريات البيض مزيجًا مع الإعدادات القابلة للقافية مثل تجارب غرفة التدفق. وعلاوة على ذلك، فإن الخلفية الوراثية للحيوانات ذات الأهمية قد تؤثر تأثيرا كبيرا على التوظيف الأساسي، مما يتطلب ضبطا دقيقا فرديا للبروتوكول المقدم. على الرغم من قيوده، قد تكون IVM بمثابة منصة لترجمة النتائج المختبرية بسهولة إلى كائن حي الفقاريات.
Introduction
المجهر الفيتفيلي (IVM) هو أداة تطبق عادة في مجال علم الأحياء الكريات البيض. تجنيد الكريات البيض يلي سلسلة من الأحداث المحددة جيدا التي بدأتها التقاط الكريات البيض، المتداول والالتصاق إلى الجدار الانبهي، وأخيرا نقل الهجرة وextravasation من الكريات البيض إلى الموقع الفعلي للالتهاب1. يتم التوسط في كل خطوة والتحكم فيها من قبل مختلف chemokines (على سبيل المثال، IL-8/CXCL8)، ومستقبلات (على سبيل المثال، LFA-1، ماك-1) والجزيئات الالتصاق الخلايا الانفحلية المقابلة (على سبيل المثال، ICAM-1، VCAM-1 و E-Selectin)2،,3. التفاعل بين المواقع التنظيمية المختلفة، والعوامل المسيطرة والوسطاء من الكريات البيضاء تجنيد سلسلة مثل مستقبلات المنتجات النهائية الجليسيشن المتقدمة (الغضب)، جزيء الالتصاق بين الخلايا 1 (ICAM-1)، C-X-C عزر ligand (CXCL)1/2 وتم الكشف عن مستقبلاتهم CXCR2 باستخدام IVM44،5،,6،,7،,8،99.
وقد وصفت طريقة IVM لكثير من الأجهزة والأنسجة المختلفة مثل الأمعاء10، الجلد11، الغدد الليمفاوية12، كيس صفار الجنينية13 وغيرها. ومع ذلك، فإن الطريقة الأكثر دراسة على نطاق واسع من IVM هو نموذج cremaster، وصفت لأول مرة في الفئران14. في حين لا تزال تستخدم في الفئران15، يتم تطبيق هذه الطريقة في الوقت الحاضر بشكل رئيسي في الفئران بسبب وفرة عالية من خطوط المعدلة وراثيا مختلفة. وقد أبرزت مجموعتنا مؤخرا الدور المحتمل للcremaster IVM في مجال الموسكولاثات الالتهابية مثل دوشين ضمور العضلات (DMD) دراسة dystrophin ناقص mdx الفئران16. نظرًا لتكوين الألياف الرقيق المتشابك ة والسهل الوصول إليه ، تمثل عضلة الكريماستر العضلات المرشحة المثالية التي يجب دراستها كجبل كامل باستخدام المجهر الخفيف أو الفلوري. تجنيد الكريات البيض وextravasation أساسا تجري في الأفيين ما بعد الشعرية، والتي يمكن بسهولة أن تحدد على طبقة العضلات المستمرفي العضلات الكريماستر.
ميزة في التصوير الحي مقارنة مع غيرها من المقالات في المختبر هو سياقها البيولوجي في كائن حي. في الوقت نفسه، قد يتطلب تحديد المساهمات الخاصة بالخلايا في توظيف الكريات البيض المعدلة نماذج إضافية في المختبر مثل غرف التدفق أو المقالات البطانية. إن الجمع بين أساليب متعددة سوف ينتج بيانات أكثر إقناعاً. يجب أن يكون العلماء على بينة من القيود المفروضة على نموذج cremaster كما أي تلاعب الجراحية سيؤدي إلى زيادة الاتجار الكريات البيض والتجنيد. ومن ثم، يصعب تقدير التوظيف الأساسي بهذه الطريقة. على الرغم من تطبيقه على نطاق واسع ، يمكن أن يكون IVM من cremaster تحديًا وقد يستغرق الإعداد الجديد وقتًا وموارد لإنشاء. نحن نقدم الآن بروتوكول سهل من شأنه أن يساعد على تجنب بعض الأخطاء الشائعة في IVM. كما سيتم مناقشة القيود وسيتم تسليط الضوء على الطرق المجانية عند الاقتضاء.
IVM من الكريماستر يمثل نهجا مثاليا ليتم تنفيذه في مجال الدراسات الالتهابية والمعدية. وبشكل أكثر تحديدا، قد يكون نموذج cremaster ذات أهمية عالية للعلماء الذين يدرسون بيولوجيا العضلات الهيكل العظمي في سياق الأمراض الالتهابية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدمت على نطاق واسع IVM كوسيلة لدراسة أنواع مختلفة من الخلايا في أجهزة مختلفة، وقد وصفت على نطاق واسع ونوقشت19. والهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو توفير نهج فعال لإعداد وتنفيذ IVM في العضلات cremaster. ممارسة هذه الطريقة سوف تسفر عن نتائج موثوقة وقابلة للاستنساخ. وبالتالي، فإن الت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت هذه الدراسة وزارة التعليم والبحوث الاتحادية الألمانية (BMBF) 01GL1746E كجزء من اتحاد بريمال. يعترف المؤلفان ببريتا هيكمان وسيلفيا بزر للحصول على مساعدة تقنية ماهرة.
Materials
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zanardo, R. C. O., et al. A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions. Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).
- Woodfin, A., et al. ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia. Blood. 127 (7), 898-907 (2016).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo. Blood. 116 (5), 841-849 (2010).
- Braach, N., et al. RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C. PloS One. 9 (2), 89422 (2014).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner. BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).
- Braach, N., et al. Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner. Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).
- Girbl, T., et al. Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis. Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).
- Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).
- Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).
- von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. Microcirculation. 3 (3), 287-300 (1996).
- Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
- Grant, R. T. Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).
- Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle. Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).
- Kranig, S. A., et al. Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice. Pediatric Research. 11, 4457 (2019).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).
- Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels. Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Nussbaum, C., et al. Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny. Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).
