インビタル顕微鏡で評価されたマウスにおけるクレマスター筋の白血球浸潤
Summary
ここでは、マウスクレマスター筋の毛細管後小胞に対して生体内顕微鏡を行う方法を示す。炎症および敗血症の異なるモデル、特にケモカインおよびサイトカインによって誘発されるものに一般的に適用され、我々は誇張された筋白血球浸潤を伴うムスコロパシーの研究におけるその関連性を強調する。
Abstract
インビボでの白血球採用カスケード内の生理学的および病態生理学的プロセスを監視するために、生体内顕微鏡(IVM)が広く使用されています。現在のプロトコルは、マウスの無傷の生物内の骨格筋由来組織における白血球のリクルートに至る白血球内皮相互作用を可視化する実用的で再現可能な方法を表す。このモデルは、顆粒球活性化と疾患におけるその役割に焦点を当てた研究のすべての分野に適用可能です。
私たちは、メソッドをガイドし、潜在的な落とし穴や技術的な困難を強調するために、ステップバイステッププロトコルを提供します。このプロトコルは、実験設定および必要な材料、マウスの麻酔、クレマスター筋の解剖、気管および頸動脈のカヌレーション、IVM記録およびオフライン分析をカバーする。接着白血球、転がりフラックス(RF)および転がりフラックス分率(RFF)のようなデータフォーマットは詳細に説明され、適切な適用が議論される。ジストロフィン欠損mdxマウスの代表的な結果は、結果セクションに提供される。
IVMは、インビボの設定で白血球の採用を評価するための強力なツールです。しかしながら、例えば内皮および白血球機能を解いて、流れチャンバ実験のようなex vivoのセットアップとの組み合わせを必要とするかもしれない。さらに、対象となる動物の遺伝的背景は、ベースラインの採用に大きな影響を与え、提供されるプロトコルの個々の微調整を必要とする。その制限にもかかわらず、IVMは、インビトロ所見を生きている脊椎動物生物に容易に翻訳するためのプラットフォームとして機能する可能性があります。
Introduction
インビタル顕微鏡(IVM)は、白血球生物学の分野で一般的に適用されるツールです。白血球のリクルートは、白血球の捕獲、圧延および接着によって開始された明確に定義された事象のカスケードに続き、最後に白血球の炎症部位へのトランスマイグレーションおよび飛散1.各ステップは、様々なケモカイン(例えば、IL-8/CXCL8)、受容体(例えば、LFA-1、Mac-1)および対応する内皮細胞接着分子(例えば、ICAM-1、VCAM-1およびE-Selectin)2、3によって媒介および制御される。2,3異なる調節部位の相互作用により、進行糖化末端製品の受容体様に白血球採用カスケードの制御因子およびメディエーター(RAGE)、細胞間接着分子1(ICAM-1)、C-X-Cモチーフリガンド(CXCL)1/2およびそれらの受容体CXCR2をIVM4、5、6、7、8、9を用いて発見した。4,5,6,7,8,9
IVMの方法は、腸10、皮膚11、リンパ節12、胚黄身袋1113等のような多くの異なる器官および組織について説明されている。しかし、IVMの最も広く研究されている方法は、クレマスターモデルであり、まずラット14に記載される。ラット15にまだ使用されているが、この方法は、異なるトランスジェニックラインの豊富さのために、今日では主にマウスに適用されている。我々のグループは最近、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)がジストロフィン欠乏mdxマウス16を研究するような炎症性ムスコロパシーの分野におけるクレマスターIVMの潜在的な役割を強調した。薄い織り交ぜられた容易に利用できる繊維組成物のために、クレマスター筋肉は光または蛍光顕微鏡を使用して全体の台座として研究される理想的な候補筋肉を表す。白血球の募集および外挿は主に毛細血管後の小胞で行われ、クレマスター筋の連続的な筋肉層で容易に同定することができる。
インビボイメージングの他のインビトロアッセイと比較した利点は、生体におけるその生物学的文脈である。同時に、変化した白血球の採用に対する細胞特異的寄与を非行化するには、フローチャンバーや内皮アッセイのような追加のインビトロモデルが必要になる可能性がある。複数のメソッドを組み合わせて使用すると、最も説得力のあるデータが得られます。外科手術は白血球の人身売買や採用の増加につながるため、科学者はクレマスターモデルの限界を認識する必要があります。したがって、ベースライン採用はこの方法で見積もることは困難です。その広範なアプリケーションにもかかわらず、cremasterのIVMは困難であり、新しいセットアップは確立に時間とリソースを要する可能性があります。IVM の一般的なミスを回避するのに役立つ簡単なプロトコルを提供します。また、制限事項について説明し、適用可能な場合は無料の方法が強調表示されます。
クレマスターのIVMは、炎症性および感染性研究の分野で実施される理想的なアプローチを表す。より具体的には、cremasterモデルは、炎症性疾患の文脈で骨格筋生物学を研究している科学者に高い関心を持つ可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
IVMは、さまざまな器官の異なる細胞型を研究するために広く使用されており、広く説明され、議論されてきた19.この研究の主な目的は、クレマスター筋肉でIVMをセットアップし、実行するための効率的なアプローチを提供することです。この方法を実践すれば、信頼性が高く再現性の高い結果が得られます。したがって、計画と標準化は、技術を習得するための重要な要素?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、PRIMALコンソーシアムの一環として、ドイツ連邦教育研究省(BMBF)01GL1746Eによって支援されました。著者らは、ブリッタ・ヘックマンとシルビア・ペザーが巧みな技術支援を認めている。
Materials
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
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