Summary
هنا، نعرض كيفية إجراء المجهر intravital على الأفير ما بعد الشعرية من العضلات كريسماستر الماوس. تطبق عادة على نماذج مختلفة من الالتهاب والإنتان، وخاصة تلك الناجمة عن chemokines والسيتوكينيات، ونحن تسليط الضوء على أهميتها في دراسة الموسكولوباثالتي التي تنطوي على تسرب الكريات البيض العضلي مبالغ فيها.
Abstract
يستخدم المجهر اللاحيفي (IVM) على نطاق واسع لمراقبة العمليات الفسيولوجية والفسيولوجية المرضية داخل سلسلة توظيف الكريات البيض في الجسم الحي. يمثل البروتوكول الحالي طريقة عملية وقابلة للاستنساخ لتصور تفاعل البطانة البيض الكريات البيض مما يؤدي إلى تجنيد الكريات البيض في الأنسجة المشتقة من العضلات الهيكلية داخل الكائن السليم للفأرة. النموذج ينطبق على جميع مجالات البحوث التي تركز على تنشيط الحبيبية ودورها في المرض.
نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لتوجيه من خلال الأسلوب وتسليط الضوء على المزالق المحتملة والصعوبات التقنية. يغطي البروتوكول الجوانب التالية: الإعدادات التجريبية والمواد المطلوبة ، وتخدير الماوس ، وتشريح عضلة cremaster وكذلك القصبة الهوائية والإزالة السباتية ، وتسجيلات IVM والتحليل غير المتصل بالإنترنت. يتم شرح تنسيقات البيانات مثل الكريات البيض الملتصقة ، وتدفق المتداول (RF) وكسر التدفق المتداول (RFF) بالتفصيل ويتم مناقشة التطبيقات المناسبة. يتم توفير النتائج التمثيلية من الفئران mdx mdx dystrophin ناقص في قسم النتائج.
IVM هو أداة قوية لتقييم تجنيد الكريات البيض في وضع في الجسم الحي; ومع ذلك، قد يتطلب تحديد على سبيل المثال وظيفة الانبوثيوليال والكريات البيض مزيجًا مع الإعدادات القابلة للقافية مثل تجارب غرفة التدفق. وعلاوة على ذلك، فإن الخلفية الوراثية للحيوانات ذات الأهمية قد تؤثر تأثيرا كبيرا على التوظيف الأساسي، مما يتطلب ضبطا دقيقا فرديا للبروتوكول المقدم. على الرغم من قيوده، قد تكون IVM بمثابة منصة لترجمة النتائج المختبرية بسهولة إلى كائن حي الفقاريات.
Introduction
المجهر الفيتفيلي (IVM) هو أداة تطبق عادة في مجال علم الأحياء الكريات البيض. تجنيد الكريات البيض يلي سلسلة من الأحداث المحددة جيدا التي بدأتها التقاط الكريات البيض، المتداول والالتصاق إلى الجدار الانبهي، وأخيرا نقل الهجرة وextravasation من الكريات البيض إلى الموقع الفعلي للالتهاب1. يتم التوسط في كل خطوة والتحكم فيها من قبل مختلف chemokines (على سبيل المثال، IL-8/CXCL8)، ومستقبلات (على سبيل المثال، LFA-1، ماك-1) والجزيئات الالتصاق الخلايا الانفحلية المقابلة (على سبيل المثال، ICAM-1، VCAM-1 و E-Selectin)2،,3. التفاعل بين المواقع التنظيمية المختلفة، والعوامل المسيطرة والوسطاء من الكريات البيضاء تجنيد سلسلة مثل مستقبلات المنتجات النهائية الجليسيشن المتقدمة (الغضب)، جزيء الالتصاق بين الخلايا 1 (ICAM-1)، C-X-C عزر ligand (CXCL)1/2 وتم الكشف عن مستقبلاتهم CXCR2 باستخدام IVM44،5،,6،,7،,8،99.
وقد وصفت طريقة IVM لكثير من الأجهزة والأنسجة المختلفة مثل الأمعاء10، الجلد11، الغدد الليمفاوية12، كيس صفار الجنينية13 وغيرها. ومع ذلك، فإن الطريقة الأكثر دراسة على نطاق واسع من IVM هو نموذج cremaster، وصفت لأول مرة في الفئران14. في حين لا تزال تستخدم في الفئران15، يتم تطبيق هذه الطريقة في الوقت الحاضر بشكل رئيسي في الفئران بسبب وفرة عالية من خطوط المعدلة وراثيا مختلفة. وقد أبرزت مجموعتنا مؤخرا الدور المحتمل للcremaster IVM في مجال الموسكولاثات الالتهابية مثل دوشين ضمور العضلات (DMD) دراسة dystrophin ناقص mdx الفئران16. نظرًا لتكوين الألياف الرقيق المتشابك ة والسهل الوصول إليه ، تمثل عضلة الكريماستر العضلات المرشحة المثالية التي يجب دراستها كجبل كامل باستخدام المجهر الخفيف أو الفلوري. تجنيد الكريات البيض وextravasation أساسا تجري في الأفيين ما بعد الشعرية، والتي يمكن بسهولة أن تحدد على طبقة العضلات المستمرفي العضلات الكريماستر.
ميزة في التصوير الحي مقارنة مع غيرها من المقالات في المختبر هو سياقها البيولوجي في كائن حي. في الوقت نفسه، قد يتطلب تحديد المساهمات الخاصة بالخلايا في توظيف الكريات البيض المعدلة نماذج إضافية في المختبر مثل غرف التدفق أو المقالات البطانية. إن الجمع بين أساليب متعددة سوف ينتج بيانات أكثر إقناعاً. يجب أن يكون العلماء على بينة من القيود المفروضة على نموذج cremaster كما أي تلاعب الجراحية سيؤدي إلى زيادة الاتجار الكريات البيض والتجنيد. ومن ثم، يصعب تقدير التوظيف الأساسي بهذه الطريقة. على الرغم من تطبيقه على نطاق واسع ، يمكن أن يكون IVM من cremaster تحديًا وقد يستغرق الإعداد الجديد وقتًا وموارد لإنشاء. نحن نقدم الآن بروتوكول سهل من شأنه أن يساعد على تجنب بعض الأخطاء الشائعة في IVM. كما سيتم مناقشة القيود وسيتم تسليط الضوء على الطرق المجانية عند الاقتضاء.
IVM من الكريماستر يمثل نهجا مثاليا ليتم تنفيذه في مجال الدراسات الالتهابية والمعدية. وبشكل أكثر تحديدا، قد يكون نموذج cremaster ذات أهمية عالية للعلماء الذين يدرسون بيولوجيا العضلات الهيكل العظمي في سياق الأمراض الالتهابية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إيواء الحيوانات تحت ظروف خاضعة للرقابة وخالية من مسببات الأمراض في IBF (Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung)، هايدلبرغ. تمت الموافقة على جميع الإجراءات المذكورة هنا من قبل IRB المحلية وRegierungspraesidium كارلسروه، بادن فورتمبرغ، ألمانيا.
1. إدارة التخدير
- تُشَعَيّر الفأرة عن طريق حقن البولوس (i.p.) بـ 125 ملغم/كغ من الكيتامين و12.5 ملغم/كغ xylazine.
- ضع الماوس وأصلحه في وضع دوري على وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم للفأرة (36.5-38 درجة مئوية). استخدام خياطة معقمة غير قابلة للامتصاص (6/0) لالرياح حلقة بسيطة حول الأسنان الأمامية والشريط نهايات الانضمام من خياطة إلى وسادة التدفئة. يهدف هذا التثبيت إلى إبقاء الفم مفتوحًا من أجل تجنب الاضطراب في التنفس.
- تحقق من الماوس للحصول على عمق مناسب من التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم بين الرقمية (لا ينبغي أن ينظر إلى الانسحاب).
- مرة واحدة يتم الوصول إلى التخدير كافية المضي قدما في إعداد الجراحية. تأكيد التخدير مرارا وتكرارا على طول التجربة الجارية كل 30 دقيقة. إعادة إعطاء الأدوية على النحو المبين أعلاه إذا لزم الأمر.
- محلول الملح الفسيولوجي Equilibrate (PSS، التركيب: 132 ملليمول/لتر ناكل، 4.7 ملليمول/لتر KCl، 1.2 مليمول/لتر MgS04،2.0 مليمول/لتر CaCl2، 18 ملليمول/لتر ناهكو3)مع 5% CO2/95% N2 لمدة 15 دقيقة. فقاعة PSS باستمرار مع 5٪ CO2/95٪ N2 طوال التجربة والحفاظ على 37 درجة مئوية.
2. الإعداد الجراحي للالقصبة الهوائية والشريان السباتي (اختياري)
- تشريح الجلد من منطقة الرقبة عن طريق سحب الجلد بلطف مع ملاقط في خط الوسط. استخدام مقص لتطبيق قطع دائريمن 1-2 سم في القطر لإعطاء مساحة كافية لإعداد الجراحية.
- تشريح بعناية العضلات المحيطة بها، والدهون والأنسجة الضامة باستخدام ملاقط.
- جعل قطع عرضية (~ 1.3 ملم) في القصبة الهوائية باستخدام مقص الجراحية الصغيرة وإدخال أنبوب البولي ايثيلين (I.D x O.D. 0.034 "x 0.050") داخل نهاية caudal من القصبة الهوائية لتأمين الشعب الهوائية العليا.
- إصلاح أنبوب يقع في القصبة الهوائية من قبل خياطة عقدة دائرية واحدة (6/0 USP).
- حدد موقع الشريان السباتي على طول الجانب الأيمن من القصبة الهوائية وتشريح الأنسجة المحيطة من جدار الشريان السباتي. بدلا من ذلك، يمكن استخدام الوداجي أو أيضا الوريد الذيل للوصول i.v. في محاولة لتجنب إصابة العصب المبهم، كما هو موجود عن كثب.
- تمرير قطعتين من خياطة (6/0) تحت الشريان السباتي. ضع أول خياطة قحفية قريبة، بالقرب من تشعب الشرايين السباتية وربطها بشكل دائم. سيتم تحديد موقع الغرزة الثانية حوالي 5-8 مم من أول واحد ، وبعد ذلك سيتم استخدامها لتأمين الأنبوب في الشريان السباتي. لا تربطه بعد.
- إعداد أنبوب البولي إيثيلين (I.D x O.D. 0.011" × 0.024") بطول 30 سم عن طريق ثني جزء النهاية إلى إبرة حقنة 1 مل مليئة بالمالحة (0.9٪ NaCl). التنظيف الدقيق مهم لمنع انسداد الهواء أثناء التحضير.
- استخدام مقطع وعاء 7 ملم لقط الشريان السباتي بشكل منتفخ من خياطة الثاني.
- قم بإجراء قطع عرضي صغير (~ 0.5 مم) في الشريان السباتي وإدخال أنبوب البولي إيثيلين المعقم. تأمين الأنبوب في الشريان باستخدام خياطة الثاني أعدت من قبل.
- إزالة مقطع السفينة وبلطف تطبيق القليل من التوتر على حقنة متصلة أنبوب البولي ايثيلين. يمكن الآن استخدام هذه القسطرة السباتية لإدارة الأدوية أو أخذ عينات الدم إذا لزم الأمر ، حتى مراقبة ضغط الدم أو معدل النبض ممكن مع الأجهزة المعنية.
3. إعداد جراحي للعضلة الكريماستر
- نقل الماوس على لوحة التدفئة (جنبا إلى جنب مع لوحة التدفئة) إلى الإطار البلاستيك حسب الطلب عقد المرحلة للميكروسكوبية في وقت لاحق. توجيه الماوس مع كيس الصفن التي تواجه مرحلة المجهر.
- إعادة تقييم عمق التخدير قبل المتابعة؛ إعادة إعطاء ربع إلى نصف جرعة من التخدير إذا لزم الأمر.
- توطين كيس الصفن، والاحتفاظ به في الجزء الأكثر distal باستخدام ملاقط، وسحبه بلطف وقطع مقطع دائري من الجلد الصفن مع حوالي 5 ملم في القطر. تأكد من عدم إيذاء الهياكل الأساسية مثل العضلات الكريماستر. تأكد من الحفاظ على الأنسجة المفتوحة رطبة جيدا مع محلول المالحة.
- تشريح النسيج الضام فضفاضة باستخدام اثنين من ملاقط وتوطين كل الخصيتين.
- عقد واحد testis distly وتبدأ بلطف سحبه بها، وإزالة الأنسجة الضامة المحيطة خطوة بخطوة.
- بمجرد أن يتم الخارجي الخصية، دبوس نهايته اقاصية إلى حلقة مطاطية المحيطة المرحلة. عند التغريب، هيدرات الأنسجة مع محلول ملحي خلال العملية برمتها.
- الخطوة الحرجة: إزالة النسيج الضام بعناية دون الإضرار العضلات الأساسية. قد تعيق الأنسجة الضامة الزائدة الرؤية في المجهر في وقت لاحق وقد تنتج صورًا ضبابية.
- دبوس الجزء القاصي من الخصية إلى أسفل وفتح العضلات كريمر من قبل قطع عرضية صغيرة (حوالي 1 ملم)، تليها شق طولي من الغاية جدا إلى نهاية قريبة. ونتيجة لذلك ينبغي أن العضلات cremaster فتح spherically. لا ينبغي قطع السفينة مرئية بمنظار، لأن هذا قد يؤثر على الديناميكا الدموية.
- نشر العضلات بعناية على خشبة المسرح الزجاجي وتثبيته على حلقة مطاطية. تأكد من عدم لمس أو إيذاء المنطقة الوسطى، كما سيتم إجراء المجهر هنا.
تحذير: قد يؤدي التمدد الزائد إلى إعاقة تدفق الدم. - قم بتثبيت الخصية المتبقية جانباً لإعطاء الوصول إلى المنطقة ذات الاهتمام. تأكد من ترطيب مع PSS مرارا وتكرارا لمنع التجفيف. العضلات المركبة جاهزة الآن للتنظير المجهري.
4. الفحص المجهري داخل الفيتال
- ضع العضلات المثبتة في المجهر المنتصب وقم بإجراء المجهر باستخدام هدف 40x.
- الحصول على البيانات والتصدير باستخدام الطيف التصويري عالي الإنتاجية.
- أداء التسجيلات تحت superfusion المستمر مع محمّى مسبقا (35-37 درجة مئوية) PSS17. تطبيق superfusion بواسطة أنابيب صغيرة التي تم تسجيلها على الهدف تستقيم من المجهر للسماح نازف مستمر من PSS جنبا إلى جنب مع الهدف وصولا الى الأنسجة العضلية.
- تحديد الأفيان ما بعد الشعرية (التقاء سفينتين أصغر) وقياس دوران الأوعية الدقيقة على الأفيون التي يبلغ قطرها 20-40 ميكرومتر.
- تسجيل صور عالية الدقة من دوران الأوعية الدقيقة من العضلات cremaster في نطاق زمني من 30 s. كما قد يكون هناك تقلص طفيف والاسترخاء من الأنسجة العضلية أثناء التسجيل، تأكد من ضبط التركيز باستمرار. عموما، الماوس يميل إلى عرض دوران مستقر لمدة 2 ساعة تقريبا. من الممكن الحصول على عدة تسجيلات لسفن مختلفة من مناطق مختلفة. يمكن استخدام اختبار واحد أو كليهما لاحقًا.
ملاحظة: لأن هذا هو نموذج من الالتهاب، وطرق شائعة من التعريفي هي: تطبيق الجهازية أو حقن الصفن المحلي من الوسطاء التهابات الموالية، فضلا عن superfusion مع على سبيل المثال ن-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP). يستخدم التحفيز المحلي TNF-α عادة ً لتحفيز تجنيد الكريات البيض. LPS الناجمعن endotoxemia هو نموذج من التهاب الجهازية الحادة SIRS.
5. التصور الكريات البيض
ملاحظة: يمكن بسهولة رؤية الكريات البيض الملتصقة والمتداولة دون مزيد من التصور. لتحديد سرعة خط الوسط من الكريات البيض تتحرك بحرية، أداء تلطيخ التفاضلية.
- إذا تم استخدام الفئران المسماة eGFP، قم بتحليلها مباشرة عن طريق المجهر الفلوري.
- لسلالات الماوس غير eGFP المسمى، استخدم تلطيخ الروداامين.
- إدارة rhodamine 6G في 0.2 ملغ / كجم وزن الجسم. قد تكون هناك حاجة إلى جرعات متكررة لتحقيق كثافات تلطيخ كافية. تأكد من الاحتفاظ بكميات صغيرة، حيث قد تؤثر وحدات التخزين الأكبر على المعلمات الهيموديناميكية.
- للتلطيخ الفوري للكريات البيض، وإدارة وصمة عار عن طريق الشريان السباتي. إذا لم يتم إجراء تشريح الشريان السباتي ، يمكن تحقيق تلطيخ كاف ٍ عن طريق تطبيق i.p. باستخدام نفس الجرعة18. كبديل للقسطرة الشريان السباتي، يمكن إجراء أي قسطرة الوريدية أخرى.
ملاحظة: نضع في اعتبارنا أن تلطيخ الرودامين، على عكس تسمية eGFP، يظهر اضمحلال الوقت من شدة الفلورسان، فضلا عن الحد الأقصى للتلطيخ الشامل من حوالي 80٪ من الكريات البيض في تركيزات أعلى. - تصور تتحرك بحرية روداامين الكريات البيض الملطخة عن طريق المجهر الفلوري.
6- نهاية التجربة
ملاحظة: يجب أن يكون الوقت المقدر الإجمالي لتنفيذ هذا البروتوكول 90 - 150 دقيقة.
- إنهاء تجربة القتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم.
- لمزيد من التحليلات، مثل الهجرة، إصلاح العضلات cremaster في PFA في حين لا تزال امتدت على خشبة المسرح وملطخة لعلم الأنسجة على النحو المطلوب.
7. التحليل دون اتصال
- تحليل المعلمات التالية كعدد بسيط أثناء تشغيل الفيديو.
- حساب تدفق المتداول [عدد / دقيقة]: عدد الخلايا المتداول تمرير خط وهمي / دقيقة
- حساب التصاق [عدد / مم2]: عدد الخلايا لاصقة إلى جدار السفينة داخل مجال الرؤية ≥ 30 s / سطح الأوعية الدموية [مم2].
- قياس المعلمات التالية هياميكاناالحيوية والأوعية الدموية الدقيقة يتم قياسباستخدام ImageJ.
- حساب قطر السفينة [μm] وقطر الجدار الداخلي.
- حساب طول السفينة [μm] كطول خط الوسط للوعاء.
- حساب سرعة خط
الوسط التي تم الحصول عليها من تحليل الفيديو من الإطار إلى الإطار من الكريات البيض تتحرك بحرية في خط الوسط.
- استخدم المعادلات التالية كتقدير.
- حساب سطح الأوعية الدموية في [مم2]: طول السفينة [μm] × قطر السفينة [μm] × × 10-6.
- حساب معدل
القص الجدار: 4.9 x (8 × سرعة خط الوسط × 0.625/قطر السفينة [μm]). - حساب متوسط سرعة تدفق الدم: سرعة خط الوسط × 0.625.
حساب مجموع تدفق الكريات البيض: عدد 
الكريات البيض الجهازية x (متوسط سرعة تدفق الدم 
× 60/1000) x x .- حساب تدفق المتداول جزء [%]: تدفق المتداول / مجموع تدفق الكريات البيض x 100.
الوسط التي تم الحصول عليها من تحليل الفيديو من الإطار إلى الإطار من الكريات البيض تتحرك بحرية في خط الوسط.
القص الجدار: 4.9 x (8 
حساب مجموع تدفق الكريات البيض: عدد 
الكريات البيض الجهازية 
× 60/1000) x x .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
سوف IVM وفقا للبروتوكول المقدمة تسفر عن رؤى فريدة من نوعها في سلسلة من تجنيد الكريات البيض في العضلات الهيكل العظمي. وسيركز قسم النتائج على النتائج النموذجية التي حصل عليها مركز الإدارة المكانية للنتائج ويسلط الضوء على المشاكل المحتملة التي قد تواجهها.
ويرد الإعداد التجريبي للميكروسكوبية داخل الحيوية في الشكل 1. إعداد العضلات cremaster وإزالة النسيج الضام أمر بالغ الأهمية للحصول على صور مجهرية مركزة مع سطح موحد. النسيج الضام الزائد يؤدي في نهاية المطاف إلى صور مجهرية ضبابية(فيديو تكميلي 1)عند تنفيذ IVM. ويبين الشكل 2 الصور المجهرية التمثيلية التي يمكن الحصول عليها باستخدام IVM. أولاً، يتم تحديد لحم الغزال بعد الشعرية، الذي ينبغي أن يتراوح قطره بين 20-40 ميكرومتر، من خلال التقاء سفينتين أصغر حجماً. يمكن تصور الكريات البيض الملتصقة والمتداولة فقط ، ولا يمكن تتبع الكريات البيض المتداولة إلا في إعادة الحركة البطيئة لمقاطع الفيديو المسجلة. يتم تعريف عدد الكريات البيض الملتصقة على أنها الكريات البيض الثابتة على مدى 30 ثانية ويتم التعبير عنها لكل مم2 من سطح السفينة(الشكل 2). يتم حساب عدد الكريات البيض المتداول التي تمر مقطع عرضي محدد سابقًا من السفينة؛ يمكن الحصول على سرعات المتداول في التحليل دون اتصال. ويمكن التعبير عن المتداول كما تدفق المتداول (RF = عدد من الخلايا المتداول على خط محدد مسبقا / دقيقة) أو ككسر تدفق المتداول (RFF في % = RF / مجموع تدفق الكريات البيض تمرير السفينة). يعتمد RF بشكل كبير على عدد الخلايا المتداولة ، في حين أن RFF أقل تأثرًا بالتغيرات في عدد خلايا الدم البيضاء (WBCs). لاحظ أنه في كثير من الحالات يرتبط الالتزام بالكريات البيض والمتداول بشكل عكسي؛ عدد كبير من الكريات البيض الملتصقة قد تقلل من بركة من الخلايا المتداولة بحرية وبالتالي تخفيف الكريات البيض المتداول.
التحديات التقنية والمخاطر المحتملة
تُغلف العضلات الكريسالية الخصية وتجمع بنية كروية. لتركيب العضلات على مرحلة التسجيل ، يلزم شق طولي لفتح الكرة. وهذا قد يؤثر على microvasculature العام كما قد تكون قطع الأوعية الصغيرة. لتجنب التحيز إلى تغيير تدفق الدم ، من المستحسن اختيار المنطقة المركزية لإعادة ترتيبها. ولا ينبغي لمس هذه المنطقة أو التلاعب بها. بالإضافة إلى ذلك، قد يمنع الميكروكوتيري النزيف والتغيرات في الديناميكا الدموية الوعائية الدقيقة. تدفق الدم من الشعيرات الدموية المحيطة عموما يوفر تلميحا قيما إذا تأثر الدورة الدموية بسبب التحضير في مجال الاهتمام. بشكل عام ، تميل الأوعية الأكثر قربًا (نحو جسم الماوس) إلى إظهار دوران دقيق أفضل ، ولكن التقاط الصورة قد يكون معقدًا بسبب زيادة الحركة والاضطرابات التي تنتج عن تنفس الحيوان.
لمنع العضلات cremaster من الجفاف أثناء التسجيل المجهري ، فإن الانصهار الفائق الدائم للأنسجة بارز. سوف يؤدي عدم كفاية أو توقف الترطيب إلى تجفيف الأنسجة وفشل التجربة.
تثبيت النسيج cremaster ضروري للحفاظ على امتدت وفي مكانها. لتسطيح العضلات المُدَحَبة، يلزم أن تمتد لطيف. نتائج التمدد القليل جدا في الأنسجة غير المستوية، مما يعقد المجهر، والإفراط في التمدد سوف يحد من تدفق الدم ويضر الأنسجة. مرة أخرى تدفق الدم الشعري يوفر حالة موثوق بها من حالة الدورة الدموية الشاملة للأنسجة. الخبرة والممارسة مطلوبة لتحديد درجة التمدد عند تركيب الأنسجة.
سوف تؤثر أوقات التحضير الطويلة على الحالة الالتهابية العامة للكائن الحي وبيانات التحيز. لذلك ، تأكد من التركيز على مسألة الاهتمام أثناء تصميم التجربة والحفاظ على أوقات التحضير قصيرة عند الضرورة. إذا لم تكن هناك حاجة إلى إدارة الدواء أو المراقبة أو اختبارات الدم قد يكون إعداد المفرد من الأنسجة الكريماستر كافية.
في معظم الإعدادات، سيتم مقارنة مجموعات تجريبية مختلفة مع الحيوانات البرية نوع. ومن الأهمية المحورية التأكد من أن المعلمات الهيموديناميكية والأوعية الدموية الدقيقة متشابهة بين المجموعات التجريبية(الجدول 1). قد تؤثر العديد من المعلمات على تجنيد الكريات البيض في الجسم الحي ، بما في ذلك إخراج القلب ، قطر السفينة ، سرعة خط الوسط ، معدل القص الجدار وعدد الكريات البيض المتداولة. يعرض الجدول 1 بيانات من خطين مختلفين للفأرة المعدلة وراثياً، وماوس mdx ناقص dystrophin وماوس lys-eGFP (التعبير عن eGFP تحت مروج lys في العدلات والضامة). في حين يمكن التحكم في المعلمات مثل قطر السفينة من قبل المحقق ، فإن سرعة الخط الوسطي ومعدل القص يعتمدان على الديناميكا الدموية للمجموعة التجريبية الفردية أو سلالة الماوس. ومن الواضح أن سرعة الخط الوسطي ومعدل القص الجداري تختلف اختلافا كبيرا بين الفئران mdx وlys-eGFP(الجدول 1)مما يجعل المقارنة ذات مغزى من بيانات IVM مستحيلة (التحليل الإحصائي عن طريق اختبار t مع تصحيح ويلش ، تم تعيين أهمية في P < 0.05). تتأثر سرعة الخط المركزي بخرج القلب ومقاومة الأوعية الدموية الطرفية وحجم الأوعية داخل الالأوعية. على سبيل المثال ، يزيد حجم كبير من الروداامين أو أي مادة تجريبية أخرى تعطى عبر القسطرة السباتية من سرعة خط الوسط الشعري ة الأعلى ويمنع التقاط الكريات البيض والمتداول(فيديو تكميلي 2). على العكس من ذلك، قد يقلل فشل القلب أو التخدير العميق أو انخفاض حرارة الجسم من تدفق ما بعد الشعيرات الدموية. قبل الاقتراب من التحليل غير المتصل بالإنترنت لبيانات IVM ، يجب تحديد متطلبات جودة البيانات (على سبيل المثال المعلمات الهيموديناميكية داخل النطاقات الفسيولوجية) ، من أجل استخلاص استنتاجات ذات مغزى والحد من التحيز.
لتحديد سرعة خط الوسط، يجب تصور الكريات البيض المتداولة بحرية. إما، يمكن استخدام الكريات البيض الفلورية (كما هو الحال في الفئران lys-eGFP) أو يجب أن تكون الكريات البيض الكريات البيضاء مع الكواشف الفلورية مثل رودامين(الشكل 3). يمكن تطبيق رودامين عبر القسطرة السباتية أو كحقنة i.p. . منذ يؤخذ الروداامين تدريجيا من قبل أنواع الخلايا الأخرى كذلك, معايرة من الجرعة والوقت أمر ضروري. سوف الدوّل الزائد وفترات طويلة تنتج خلفية كبيرة أثناء المجهر.
وأخيرا، نود أن نشير إلى التنوع البيولوجي لسلالات الفئران المختلفة. وإلى جانب السلالات المعدلة وراثيا، قد تظهر سلالات النوع البري المقبولة عموما أيضا التباين الفسيولوجي. الرقم 4 يقارن 6 الأسود المستخدمة عادة (C57BL/6) إلى الأسود 10 (C57BL/10ScSn) الفئران. الأسود 6 الفئران تظهر بوضوح تعزيز المتداول، الالتصاق وهجرة الخلايا الليوكوزيت مقارنة مع الفئران 10 السوداء (التحليل الإحصائي من قبل ANOVA في اتجاه واحد مع اختبار توكي بعد مخصص تم تعيين أهمية في P < 0.05)، على الرغم من أن كلا السلالات سوف يشار إلى نوع البرية. لذلك ، يجب النظر في الخلفية الوراثية الصحيحة ، خاصة عند استخدام الفئران المعدلة وراثيا. في الإعداد التجريبي لدينا ، فإن المقارنة بين 6 فئران سوداء وفئران mdx المعدلة وراثيا (خلفية سوداء 10) تخفي إلى حد كبير الحالة الالتهابية المعززة للفئران mdx الناقصة dystrophin على خلفية النوع البري 10 السوداء الصحيحة(الشكل 4).
الشكل 1: الإعداد التجريبي التخطيطي من IVM على العضلات cremaster. بعد التخدير ، يتم تخدير القصبة الهوائية ويتم وضع قسطرة في الشريان السباتي. يتم كشف العضلات cremaster وإعدادها للمجهر ية داخل الحيوية على المجهر تستقيم باستخدام إما المجهر الخفيف أو المجهر الفلورسنت. يتم الحصول على مقاطع الفيديو للتحليل غير المتصل لاحقًا. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الجزء venule ما بعد الشعرية التمثيلي من المجهر داخل النواة مع إطارات متتابعة. يعرض العمود الأيسر صورًا مجهرية خفيفة ، للحصول على تصور أفضل ، يتم تحديد الوعاء بخطوط منقط. يتم تحديد venule بواسطة السفن المخروطية (التي تتميز بالعلامات النجمية الحمراء) وقطر السفينة من < 40 ميكرومتر. يصور العمود الأيمن تمثيلًا تخطيطيًا للصورة اليسرى المقابلة، ويظهر الكريات البيض باللون الأحمر. تعرض الصفوف الأربعة الأولى صورًا متتابعة لنفس السفينة بمرور الوقت. الصف السفلي يشير إلى الكريات البيض أتباع. في التمثيل التخطيطي ، يتم وضع علامة على الكريات البيض الفردية ومسافة المتداول الخاصة بها. في الالتزام التحليل دون اتصال لكل ملليمتر مربع، يمكن حساب تدفق المتداول وكذلك سرعة المتداول. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: يمكن تصور الكريات البيض المتداول عن طريق التعبير المعدل وراثيا من علامات الفلورسنت أو عن طريق تلطيخ الثانوية مع رودامين. صور مجهرية تمثيلية لتجنيد الكريات البيض من الكريات البيض eGFP وrhodamine المسمى الكريات البيض من ن = 3 الحيوانات لكل منهما. يمكن الكشف مباشرة عن العدلات المتداول التي تعبر عن eGFP تحت مروج lys من الفئران المعدلة وراثيا lys-eGFP عن طريق المجهر المناعي الفلوري (العمود الأيسر). قد تكون ملطخة الكريات البيض دون صانعي الفلورسنت عن طريق الحقن الوريدي أو داخل perperitoneal من رودامين (العمود الأيمن). وتجدر الإشارة إلى أن الروداامين لا يتم تناولها حصريًا من قبل العدلات ، مما يعطي خلفية أكثر بكثير. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مقارنة تجنيد الكريات البيض في سلالات مختلفة من نوع المتحولين وراثيا والبرية. (أ)يتم مقارنة تدفق جزء المتداول،(B)التصاق و (C)الهجرة من الليوكوزيت بين الأسود 6 (C57BL/6J)، الأسود 10 (C57BL/10ScSnJ) والفئران mdx (C57BL/10ScSn-DmdmdxJ)، كما هو موضح في المتوسط + SEM. الأسود 6 الفئران تظهر تعزيز تجنيد الكريات البيض مقارنة مع الأسود 10 الفئران. وبالمثل ، فإن الفئران mdx لديها توظيف أكبر مقارنة بالأسود 10 ، ولكن ليس بالمقارنة مع الفئران السوداء من النوع 6 البرية. وتبين هذه البيانات أهمية تخصيص ضوابط وراثية صحيحة. بيانات من n على الأقل = 3 الحيوانات لكل مجموعة. التحليل الإحصائي من قبل ANOVA في اتجاه واحد مع تحليل توكي بعد المخصص. تم تعيين أهمية في P < 0.05. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| سلالة الماوس | لا. من الفئران | لا. من الأفين | قطر السفينة | سرعة خط الوسط | سعر القص الجداري | WBC الجهازية |
| ن | ن | مكم | ميكرومتر/س | s-1 | /ميكرولتر | |
| Mdx | 3 | 12 | 28 ± 4 | 1150 ± 50 | 1010 ± 100 | 5200 ± 300 |
| lys-eGFP | 3 | 15 | 27 ± 2 | 2220 ± 90 | 2030 ± 90 | 5800 ± 100 |
| ف | 0.83 | 0.0005 | 0.0016 | 0.13 |
الجدول 1: بارامترات ذات صلة بحرارة الهيمودينامية والأوعية الدموية الدقيقة من خطين مختلفين للفأرة المحورة وراثيا. يتم عرض قطر السفينة وسرعة الخط المركزي ومعدل القص الجداري وWBCs النظامية لفئران mdx التي تفتقر إلى dystrophin والفئران lys-eGFP. في هذا المثال mdx الفئران (C57BL/10J، أسود 10 الخلفية) والفئران lys-eGFP (C57BL/6J، أسود 6 خلفية) تظهر سرعة خط الوسط مختلفة إحصائيا ومعدل القص الجدار ولا ينبغي مقارنتها باستخدام IVM. يتم تقديم البيانات النموذجية من n على الأقل = 3 الحيوانات لكل مجموعة على أنها متوسط ± SEM. التحليل الإحصائي عن طريق اختبار t غير مقترن مع تصحيح ويلش. تم تعيين أهمية في P < 0.05.
فيديو تكميلي 1: التأثير المجهري للإزالة غير الكافية للأنسجة الضامة على عضلة الكريماستر. يرجى الضغط هنا لمشاهدة هذا الفيديو (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
فيديو تكميلي 2: تغيير تدفق الدم إما عن طريق فرط الدم أو انخفاض ضغط الدم. يرجى الضغط هنا لمشاهدة هذا الفيديو (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد استخدمت على نطاق واسع IVM كوسيلة لدراسة أنواع مختلفة من الخلايا في أجهزة مختلفة، وقد وصفت على نطاق واسع ونوقشت19. والهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو توفير نهج فعال لإعداد وتنفيذ IVM في العضلات cremaster. ممارسة هذه الطريقة سوف تسفر عن نتائج موثوقة وقابلة للاستنساخ. وبالتالي، فإن التخطيط والتوحيد القياسي من العوامل الرئيسية لإتقان هذه التقنية. قبل كل شيء ، تعتمد هذه التقنية بشكل كبير على المعلمات الهيموديناميكية والأوعية الدموية الدقيقة ، والتي تحتاج إلى مراقبة ومراقبة عن كثب. وعلى هذا النحو، فإن الديناميكا الدموية المختلفة بين المجموعات سوف تسفر عن نتائج مضللة.
على الرغم من دورها في دراسة الظروف الفسيولوجية والمرضية ، قد لا يمكن أن تُكشف IVM وحدها بشكل كامل المساهمة الفردية لأنواع خلايا محددة في تجنيد الكريات البيض في الالتهاب. وللقيام بذلك، يمكن الجمع بين أساليب تكميلية أخرى مع IVM. على سبيل المثال، قد تحدد أساليب الحي مثل تجارب غرفة التدفق بين آثار البطانة أو الكريات البيض. أيضا، غرف التدفق هي الاجهزة ممتازة لترجمة النتائج القوارض إلى الكريات البيض الإنسان، على سبيل المثال في الأطفال حديثي الولادة20. وعلاوة على ذلك، في أساليب المختبر مثل FACS أو الكيمياء المناعية ينبغي أن تكمل تجارب IVM. وقد تضيف كل طريقة معلومات محددة تم الحصول عليها من بيئة خاضعة للرقابة مع القليل من العوامل المربكة.
إعداد الكريسماستر الصدمة المعروضة هنا يشبه الظروف الأساسية الفسيولوجية للالتهاب أقرب ما يمكن. ومع ذلك ، فإن التحضير الجراحي الإلزامي في حد ذاته هو حافز للالتهاب ، والذي يجب النظر فيه للتفسير. قد يوفر تحفيز TNF الدوائي للأنسجة الدماغية وضعًا إضافيًا لتعزيز التجنيد الالتهابي خارج التحفيز الجراحي الصادم16. علاوة على ذلك ، قد تظهر سلالات الماوس المختلفة استجابات متغيرة تجاه المحفزات الموحدة. لقد أثبتنا أنه حتى سلالات النوع البري ة الشائعة قد تظهر حالات خط أساس مختلفة من تجنيد الكريات البيض. وهذا يدل على أهمية تعيين الضوابط الوراثية الصحيحة، وإنشاء بيانات خط الأساس للمجموعات التجريبية الجديدة عند التخطيط للتجارب. وبما أن السلالات المعدلة وراثياً وفيرة للغاية في هذه الأيام، فمن المرجح أن تختلف حتى نفس السلالات مع مرور الوقت اعتماداً على التكاثر.
إذا ما أخذت معا، IVM هو أداة قوية لرصد تجنيد الكريات البيض في السياق البيولوجي للفأرة، وينبغي أن تكون مصحوبة مع vivo السابقين وتقنيات في المختبر. علاوة على ذلك ، يسمح cremaster IVM بمجموعة متنوعة من الأوضاع المختلفة بما في ذلك تلطيخ خلايا محددة أو تحفيز التهابي أو تلاعب دوائي والعلاج المسبق. على هذا النحو قد تكون بمثابة منصة لتقييم الوسطاء الدوائية المختلفة وآثارها البيولوجية في الدراسات قبل السريرية وخاصة في مجال الالتهاب وبشكل أكثر تحديدا في الاضطرابات العضلية الالتهابية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعمت هذه الدراسة وزارة التعليم والبحوث الاتحادية الألمانية (BMBF) 01GL1746E كجزء من اتحاد بريمال. يعترف المؤلفان ببريتا هيكمان وسيلفيا بزر للحصول على مساعدة تقنية ماهرة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zanardo, R. C. O., et al. A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions. Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).
- Woodfin, A., et al. ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia. Blood. 127 (7), 898-907 (2016).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo. Blood. 116 (5), 841-849 (2010).
- Braach, N., et al. RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C. PloS One. 9 (2), 89422 (2014).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner. BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).
- Braach, N., et al. Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner. Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).
- Girbl, T., et al. Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis. Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).
- Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).
- Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).
- von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. Microcirculation. 3 (3), New York, N.Y. 287-300 (1996).
- Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
- Grant, R. T. Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).
- Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle. Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).
- Kranig, S. A., et al. Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice. Pediatric Research. 11, 4457 (2019).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).
- Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels. Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Nussbaum, C., et al. Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny. Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).
