Infiltration de Leukocyte de Cremaster Muscle chez les souris évaluées par microscopie intravitale
Summary
Ici, nous montrons comment effectuer la microscopie intravitale sur les venules post-capillaires du muscle de cremaster de souris. Communément appliqués à différents modèles d’inflammation et de septicémie, en particulier ceux induits par les chimiothérapeutiques et les cytokines, nous soulignons sa pertinence dans l’étude des muscolopathies impliquant l’infiltration musculaire exagérée de leucocyte.
Abstract
La microscopie intravitale (IVM) est largement utilisée pour surveiller les processus physiologiques et pathophysiologiques dans la cascade de recrutement de leucocytes in vivo. Le protocole actuel représente une méthode pratique et reproductible pour visualiser l’interaction endothélium leucocyte menant au recrutement de leucocytes dans le tissu dérivé du muscle squelettique dans l’organisme intact de la souris. Le modèle s’applique à tous les domaines de recherche qui mettent l’accent sur l’activation des granulocytes et leur rôle dans la maladie.
Nous fournissons un protocole étape par étape pour guider à travers la méthode et pour mettre en évidence les pièges potentiels et les difficultés techniques. Le protocole couvre les aspects suivants : réglages expérimentaux et matériel requis, anesthésie de la souris, dissection du muscle cremaster ainsi que cannulation trachéale et carotide, enregistrements IVM et analyse hors ligne. Les formats de données comme les leucocytes adhérents, le flux roulant (RF) et la fraction de flux roulant (RFF) sont expliqués en détail et les applications appropriées sont discutées. Les résultats représentatifs des souris de mdx déficientes de dystrophine sont fournis dans la section des résultats.
IVM est un outil puissant pour évaluer le recrutement de leucocytes dans un cadre in vivo; cependant, la délimitation par exemple la fonction endothéliale et leucocyte peut nécessiter une combinaison avec des configurations ex vivo comme des expériences de chambre de flux. En outre, le contexte génétique des animaux d’intérêt peut grandement influencer le recrutement de base, nécessitant un réglage individuel du protocole fourni. Malgré ses limites, IVM peut servir de plate-forme pour traduire facilement les résultats in vitro en un organisme vertébré vivant.
Introduction
La microscopie intravitale (IVM) est un outil couramment appliqué dans le domaine de la biologie du leucocyte. Le recrutement de leukocyte suit une cascade d’événements bien définis initiés par la capture de leucocyte, le roulement et l’adhésion au mur endothélial, et enfin la transmigration et l’extravasation des leucocytes au site réel de l’inflammation1. Chaque étape est médiatisée et contrôlée par diverses chimiothéines (p. ex., IL-8/CXCL8), les récepteurs (p. ex., LFA-1, Mac-1) et les molécules correspondantes d’adhérence cellulaire endothéliale (p. ex., ICAM-1, VCAM-1 et E-Selectin)2,,3. L’interaction de différents sites de régulation, les facteurs de contrôle et les médiateurs de la cascade de recrutement de leucocytes comme le récepteur des produits finaux avancés de glycation (RAGE), la molécule d’adhérence intercellulaire 1 (ICAM-1), C-X-C motif ligand (CXCL)1/2 et leur récepteur CXCR2 ont été découverts en utilisant IVM4,5,6,7,8,9.
La méthode de la MIV a été décrite pour de nombreux organes et tissus différents tels que l’intestin10, la peau11, les ganglions lymphatiques12, le sac de jaune embryonnaire13 et d’autres. Cependant, la méthode la plus largement étudiée de la MIV est le modèle de cremaster, décrit pour la première fois chez les rats14. Bien qu’elle soit encore utilisée chez les rats15,la méthode est aujourd’hui principalement appliquée chez la souris en raison de la forte abondance de différentes lignées transgéniques. Notre groupe a récemment mis en évidence le rôle potentiel de cremaster IVM dans le domaine des muscolopathies inflammatoires comme la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) étudiant les souris mdx dystrophine-déficientes16. En raison de sa composition fine de fibre entrelacée et facilement accessible, le muscle de cremaster représente le muscle candidat idéal pour être étudié dans son ensemble de montage utilisant la microscopie légère ou fluorescente. Le recrutement et l’extravasation de Leukocyte ont principalement lieu dans les venules post-capillaires, qui peuvent facilement être identifiés sur une couche musculaire continue dans le muscle de cremaster.
L’avantage de l’imagerie in vivo par rapport à d’autres essais in vitro est son contexte biologique dans un organisme vivant. Dans le même temps, la délimitation des contributions spécifiques aux cellules à l’analyse altérée du leucocyte peut nécessiter des modèles in vitro supplémentaires comme les chambres de débit ou les essais endothéliaux. La combinaison de plusieurs méthodes donnera des données les plus convaincantes. Les scientifiques doivent être conscients des limites du modèle de crémaster car toute manipulation chirurgicale conduira à une augmentation du trafic et du recrutement de leucocytes. Par conséquent, le recrutement de base est difficile à estimer avec cette méthode. Malgré son application large, IVM du cremaster peut être difficile et une configuration nouvelle peut prendre du temps et des ressources à établir. Nous fournissons maintenant un protocole facile qui aidera à éviter certaines des erreurs courantes dans IVM. En outre, les limitations seront discutées et des méthodes complémentaires seront mises en évidence le cas échéant.
L’IVM du cremaster représente une approche idéale à mettre en œuvre dans le domaine des études inflammatoires et infectieuses. Plus précisément, le modèle de cremaster peut être d’un grand intérêt pour les scientifiques qui étudient la biologie du muscle squelettique dans le contexte de la maladie inflammatoire.
Protocol
Representative Results
Discussion
IVM comme méthode a été largement utilisé pour étudier différents types de cellules dans différents organes et a été largement décrit et discuté19. L’objectif principal de cette étude est de fournir une approche efficace pour mettre en place et effectuer IVM dans le muscle cremaster. La pratique de la méthode produira des résultats fiables et reproductibles. Ainsi, la planification et la normalisation sont des facteurs clés pour maîtriser la technique. Par-dessus tout, la techniq…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par le Ministère fédéral allemand de l’éducation et de la recherche (BMBF) 01GL1746E dans le cadre du Consortium PRIMAL. Les auteurs reconnaissent Britta Heckmann et Silvia Pezer pour leur assistance technique habile.
Materials
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
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