Leukocytter Infiltrasjon av Cremaster Muskel i mus vurdert av Intravital mikroskopi
Summary
Her viser vi hvordan du utfører intravital mikroskopi på post-kapillære venules av musen cremaster muskel. Vanligvis brukt på ulike modeller av betennelse og sepsis, spesielt de som er indusert av chemokiner og cytokiner, fremhever vi dens relevans i studiet av muscoloatier som involverer overdrevet muskelleukocytterinfiltrasjon.
Abstract
Intravitalmikroskopi (IVM) er mye brukt til å overvåke fysiologiske og patofysiologiske prosesser innenfor leukocytter rekruttering kaskade in vivo. Den nåværende protokollen representerer en praktisk og reproduserbar metode for å visualisere leukocytterendotelinteraksjonen som fører til leukocytterrekruttering i skjelettmuskulatur avledet vev i musens intakte organisme. Modellen gjelder for alle forskningsområder som fokuserer på granulocytteraktivering og deres rolle i sykdom.
Vi tilbyr en trinnvis protokoll for å veilede gjennom metoden og for å markere potensielle fallgruver og tekniske problemer. Protokollen dekker følgende aspekter: eksperimentelle innstillinger og nødvendig materiale, anestesi av musen, disseksjon av cremaster muskelsamt trakeal og carotis cannulation, IVM opptak og offline analyse. Dataformater som tilhengerleukocytter, fluks (RF) og rullefluksfraksjon (RFF) forklares i detalj, og passende bruksområder diskuteres. Representative resultater fra dystrophin mangelfullmdx mus er gitt i resultatseksjonen.
IVM er et kraftig verktøy for å vurdere leukocytter rekruttering i en in vivo setting; Delineating kan imidlertid for eksempel endotel- og leukocytterfunksjonen kreve en kombinasjon med ex vivo-oppsett som flytkammereksperimenter. Videre kan den genetiske bakgrunnen til dyr av interesse i stor grad påvirke baseline rekruttering, krever individuell finjustering av protokollen gitt. Til tross for sine begrensninger, kan IVM tjene som en plattform for å lett oversette in vitro funn til en levende virveldyr organisme.
Introduction
Intravitalmikroskopi (IVM) er et vanlig brukt verktøy innen leukocytterbiologi. Leukocytter rekruttering følger en kaskade av veldefinerte hendelser initiert av leukocytter fangst, rullende og vedhende til endotelveggen, og til slutt transmigrasjon og ekstravasasjon av leukocytter til selve stedet for betennelse1. Hvert trinn er mediert og kontrollert av ulike chemokines (f.eks. IL-8/CXCL8), reseptorer (f.eks LFA-1, Mac-1) og tilsvarende endotelcelleadhesjonsmolekyler (f.eks. ICAM-1, VCAM-1 og E-Selectin)2,3. Interaksjonen mellom ulike regulatoriske nettsteder, kontrollerende faktorer og mediatorer av leukocytter rekruttering kaskade som reseptor av avanserte glycation sluttprodukter (RAGE), intercellulær adhesjon molekyl 1 (ICAM-1), C-X-C motiv ligand (CXCL)1/2 og deres reseptor CXCR2 ble avdekket ved hjelp av IVM4,5,6,7, 8,,9.9
Metoden for IVM har blitt beskrevet for mange forskjellige organer og vev som tarmen10, hud11, lymfeknuter12, embryonale eggeplomme sekk13 og andre. Den mest studerte metoden for IVM er imidlertid cremaster-modellen, først beskrevet hos rotter14. Mens den fortsatt brukes i rotter15,brukes metoden i dag hovedsakelig hos mus på grunn av den høye overfloden av forskjellige transgene linjer. Vår gruppe har nylig fremhevet den potensielle rollen som cremaster IVM innen inflammatoriske muscolopathies som Duchenne Muskeldystrofi (DMD) studerer dystrophin-mangelfullmdx mus16. På grunn av sin tynne sammenvevde og lett tilgjengelige fibersammensetning representerer cremaster muskelen den ideelle kandidatmuskelen som skal studeres som en hel brakett ved hjelp av lys eller fluorescerende mikroskopi. Leukocytter rekruttering og ekstravasasjon hovedsakelig finner sted i post-kapillær venules, som lett kan identifiseres på en kontinuerlig muskellag i cremaster muskel.
Fordelen med in vivo imaging sammenlignet med andre in vitro analyser er dens biologiske kontekst i en levende organisme. Samtidig kan delineating cellespesifikke bidrag til endret leukocytterrekruttering kreve ytterligere in vitro-modeller som strømningskamre eller endotelanalyser. Kombinasjonen av flere metoder vil gi mest overbevisende data. Forskere bør være klar over begrensningene i cremaster modellen som enhver kirurgisk manipulasjon vil føre til økt leukocytter handel og rekruttering. Derfor er baseline rekruttering vanskelig å anslå med denne metoden. Til tross for sin brede anvendelse, Kan IVM av cremaster være utfordrende og en ny oppsett kan ta tid og ressurser å etablere. Vi tilbyr nå en enkel protokoll som vil bidra til å unngå noen av de vanlige feilene i IVM. Begrensninger vil også bli diskutert, og gratis metoder vil bli fremhevet der det er aktuelt.
IVM av cremaster representerer en ideell tilnærming som skal implementeres innen inflammatoriske og smittsomme studier. Mer spesifikt kan cremaster-modellen være av høy interesse for forskere som studerer skjelettmuskelbiologi i sammenheng med inflammatorisk sykdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
IVM som en metode har blitt mye brukt til å studere ulike celletyper i forskjellige organer og har blitt grundig beskrevet og diskutert19. Hovedmålet med denne studien er å gi en effektiv tilnærming til å sette opp og utføre IVM i cremaster muskelen. Praktisere metoden vil gi pålitelige og reproduserbare resultater. Dermed er planlegging og standardisering viktige faktorer for å mestre teknikken. Fremfor alt er teknikken svært avhengig av hemodynamiske og mikrovaskulære parametere, som m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av det tyske føderale utdannings- og forskningsdepartementet (BMBF) 01GL1746E som en del av PRIMAL Consortium. Forfatterne anerkjenner Britta Heckmann og Silvia Pezer for dyktig teknisk assistanse.
Materials
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zanardo, R. C. O., et al. A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions. Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).
- Woodfin, A., et al. ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia. Blood. 127 (7), 898-907 (2016).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo. Blood. 116 (5), 841-849 (2010).
- Braach, N., et al. RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C. PloS One. 9 (2), 89422 (2014).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner. BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).
- Braach, N., et al. Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner. Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).
- Girbl, T., et al. Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis. Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).
- Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).
- Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).
- von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. Microcirculation. 3 (3), 287-300 (1996).
- Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
- Grant, R. T. Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).
- Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle. Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).
- Kranig, S. A., et al. Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice. Pediatric Research. 11, 4457 (2019).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).
- Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels. Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Nussbaum, C., et al. Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny. Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).
