将葛兰阴性细菌的细胞包络分离到内膜和外膜分数，对阿辛托巴基的培养素进行技术调整
Summary
革兰氏阴性细菌产生两个空间隔离膜。外膜由围皮层和气膜层从内膜分割。分离这些微生物的双层的能力对于了解它们的生理和发病机制至关重要。
Abstract
该方法通过将Gram阴性细菌的包络分为全膜、内膜和外膜（OM）分数，最后进行检测，以评估双层的纯度。OM 与内膜相比，整体密度增加，这主要是由于外张中存在脂糖 （LOS） 和脂多糖 （LPS）。LOS 和 LPS 分子是具有类似结构的两栖糖脂，它由脂质-A 脱沙脂和核寡糖基物组成。然而，只有LPS分子用第三个子单位（称为O-多糖，或O抗原）装饰。存在的糖脂的类型和量将影响生物体的OM密度。因此，我们测试了糖脂含量变化的细菌膜是否可以使用我们的技术进行类似的分离。对于产生LPS的生物体，沙门氏菌血清型典型和大肠杆菌，膜很容易分离，LPS O抗原莫伊蒂不影响双层分裂。鲍曼尼阿辛托细菌产生LOS分子，其质量与O抗原不足的LPS分子相似;然而，这些微生物的膜最初无法分离。我们推断，A. Baumannii的OM比肠杆菌的密度小，因此对蔗糖梯度进行了调整，并分离了膜。因此，该技术可以进行调整和修改，以便与其他生物体一起使用。
Introduction
革兰氏阴性细菌产生两个膜，由围皮空间和肽多基细胞壁1分离。内膜 （IM） 包裹细胞醇，是磷脂的对称双层。Peptidoglycan 可防止黄土压，并为细菌提供细胞形状，并通过脂蛋白2、33连接到外膜 （OM）。OM 环绕着周围，主要是不对称的。内单由磷脂组成，外单由被称为脂质糖（LOS）或脂质糖（LPS）4、5的糖脂组成。4,5外文中LOS/LPS分子的脂质不对称和生物化学赋予了细胞表面屏障特性，保护细菌免受其环境中的危害。,7
LPS分子由三个成分组成：脂质A脱糖脂、核心寡糖和O-多糖或O抗原。脂质A是一种成倍的青化脱糖脂。核心寡糖由 10-15 种糖组成，称为粗糙 LPS 或 R-LPS。核心被细分为内区，由2-keto-3-脱氧-D-八氯苯酚酸（kdo）和一个或多个异丙酮残留物组成，外区域通常由异丙酮（葡萄糖或乳糖）和异糖组成，或乙酰氨基糖5。外芯区域的组成和结构比内核更可变。在沙门氏菌中，只描述了一个核心结构;然而，在大肠杆菌中有五种不同的核心结构（指定K-12、R1、R2、R3和R4）8。8大肠杆菌K-12 DH5+，我们在这个过程中使用携带突变，导致生产R-LPS9。9R-LPS分子缺乏O抗原多性，其分子量与LOS分子相似。
在R-LPS中加入O抗原，使这种分子变成平滑的LPS，或S-LPS。O抗原由短3-4碳水化合物亚单位组成，由不同链长10的多种形态组成。一些产生LPS的细菌，如沙门氏菌肠血清菌型（S.典型，在其表面10，11,11上显示LPS分子的三模态分布。超长链O抗原可以包含超过一百个子单位，重量超过一百千元。O抗原为细菌提供表面特性，这些特性是抵抗抗生素、逃避噬菌体捕食和引起疾病所必需的。
弯曲杆菌、博尔德泰拉、阿辛托细菌、血友、奈塞利亚等物种在其表面12上产生LOS分子，而不是LPS分子。LOS分子由脂质A和核心寡糖组成，但缺乏O抗原。这些类型的克拉姆阴性细菌修改其核心寡糖与额外的糖和糖的组合，以改变表面属性12。LOS和LPS产生的微生物都衍生出脂质A和核心分子上的磷酸盐，具有阳离子莫伊酸7。这些添加物包括磷脂胺、乳糖胺和氨基拉比诺替代物，它们通过中和阴离子表面电荷发挥作用，从而防止阳离子抗菌肽。革兰氏阴性细菌还用糖的可变非糖基法替代或额外的kdo分子来改变核心寡糖结构，并改变脂质-A脱糖脂7上的acyl链的数量。
将IM从克拉姆阴性细菌的OM中分离的能力有助于了解细胞包络在抗微生物药物耐药性和疾病发病机制中的作用。,12该方法的推导用于推断OM的蛋白质、磷脂和糖脂成分的组装、维护和重塑机制。
我们的实验室定期进行细菌性脂质分析，以研究各种克拉姆阴性物种中蛋白质介导的脂质调节和脂质功能。协议中使用的体积反映了这个程序的常规使用，通过薄层色谱和液色谱串质谱13，14,14分析非放射性标记的磷脂。
该协议首先将克拉姆阴性细菌的冷冻悬浮液暴露在蔗糖的高渗透溶液中，并加入溶酶酶，将OM与底层的肽多解酶层分离（图1）12。然后添加EDTA以方便淋酶的渗透，因为二价阳离子固固会破坏相邻LOS/LPS分子15之间的横向静电桥接相互作用。我们原来的协议已经适应需要形成球蛋白，一种由血浆膜和细胞溶质组成的Gram阴性细菌细胞形式，但缺乏肽多解层和OM。有可能由经过调整的方法产生球体;然而，该技术并不依赖或打算依靠它们的形成来取得成功。相反，在加压淋液之前，通过离心和重新悬浮在浓度较低的蔗糖溶液中，解压酶-EDTA处理的细菌会迅速收获。理论上，可能通过形成球蛋白释放的OEM应该从经过处理的细胞的超钠中收集，但这种方法在这里没有详细说明。最终，经过处理的细胞受到传统的均质化和赖塞，提高了膜分离程序16的效率和可重复性。
在镇理作用后，通过超离心采集总膜，并应用于不连续蔗糖密度梯度，以分馏IM和OEM。经典方法使用一个更连续的梯度，包括至少五个不同的蔗糖溶液11，12。11,我们协议中的不连续梯度由三个蔗糖解组成，并将双层划分为两个不同的分数17。Gram阴性细菌的OM中的LOS和LPS分子驱动包络分割成上棕色低密度IM分数和低白色高密度OM分数（图1和图2）。
甲酸杆菌是重要的耐多药人类病原体，在OM中产生LOS分子，并竖立一个难以分离的,细胞包络。最近的研究表明，我们在这里介绍的协议的推导可以用来分割这些生物体的两层20。因此，我们在A. baumannii 17978 上测试了我们的协议。最初，程序不够充分。然而，我们修改了中密度溶液的蔗糖浓度，并大大提高了分离（图2）。NADH脱氢酶测定和LOS/LPS提取和检测程序用于确认野生S型A.baumannii的分离。典型和两个O抗原缺乏肠细菌基因型;即，加仑-突变S。典型和实验室菌株，大肠杆菌DH5+（图3和图4）。
这项工作的目的是提供一种简化的方法，以可重现地隔离Gram阴性细菌的膜。该协议可用于研究这些微生物的多种膜相关分子。
Protocol
Representative Results
Discussion
该方法将继续帮助研究人员了解细胞包络在细菌生理学和发病机制中的作用。在顺序超中心化步骤之后，可以获得纯化的总、内和OM分数。这些膜可以单独检测，以测试与膜蛋白的定位和功能、跨近质的运输和贩运以及不同环境条件下单个双层的组成相关的假设。探索单个OM成分在发病机制（如LOS/LPS和OM蛋白）中的参与的生物研究，也可以使用该技术收集的分离膜分数在动物和细胞模型中进行。</p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由P20GM10344和R01AI139248资助，授予Z.D.Dalebroux。
Materials
| 1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene | VWR | 525-0466 | |
| 1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap | VWR | 10416-312 | |
| 2000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth | VWR | 10545-844 | |
| 4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well | BIORAD | 4561095 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer 10 mL | BIORAD | 1610747 | |
| 50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89049-174 | |
| 7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles | VWR | 71000-518 | |
| 70 mL polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter Life Sciences | 355622 | |
| Agar Powder | VWR | A10752 | |
| B10P Benchtop pH Meter with pH Probe | VWR | 89231-664 | |
| Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF – TOC (bench version) | ThermoFisher Scientific | 50136146 | |
| Benzonase Nuclease | MilliporeSigma | 70746-3 | |
| EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker | VWR | 4040-01 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin, Inc. | ||
| Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor | ThermoFisher Scientific | 75006526 | |
| Hydrochloric acid 6.0 N | VWR | BDH7204 | |
| IBI Scientific Orbital Platform Shaker | Fischer Scientific | 15-453-211 | |
| LB Broth Miller | VWR | 214906 | |
| Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade | VWR | VWRV0063 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | M2670 | |
| NADH | Sigma Aldrich | 10107735001 | |
| Optima XPN-80 – IVD | Beckman Coulter Life Sciences | A99839 | |
| Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS | Fischer Scientific | NC1624582 | |
| Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology | Sigma – Millipore | P4557 | |
| Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit | Thermofisher | 23238 | |
| Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Thermofisher | P20495 | |
| Proteacease -50, EDTA free | G Biosciences | 786-334 | |
| Proteinase K, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium hydroxide ≥99.99% | VWR | AA45780-22 | |
| Sorval RC 6 Plus Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 36-101-0816 | |
| Sucrose | MilliporeSigma | SX1075-3 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker | VWR | JT4109-6 | |
| Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 339160 | |
| Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm | Beckman Coulter Life Sciences | 344059 | |
| Vortex-Genie 2 | VWR | 102091-234 |
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