Разделение конверта клетки для Грам-отрицательных бактерий в Внутренние и Внешние фракции Membrane с Технически регулировками для Acinetobacter baumannii
Summary
Грамотрицательные бактерии производят две пространственно сегрегированные мембраны. Внешняя мембрана разделена из внутренней мембраны периплазмой и пептидогликанским слоем. Способность изолировать двойные двуслойные эти микробы имеет решающее значение для понимания их физиологии и патогенеза.
Abstract
Этот метод работает путем раздела оболочки грамотрицательных бактерий на общую, внутреннюю и внешнюю мембрану (ОМ) фракции и завершается анализами для оценки чистоты двуслойных. ОМ имеет повышенную общую плотность по сравнению с внутренней мембраной, в основном из-за присутствия липулигосахаридов (LOS) и липополисахаридов (LPS) в пределах внешней листовки. Молекулы LOS и LPS являются амфипатические гликолипииды, которые имеют аналогичную структуру, которая состоит из липидов-а disaccharolipid и ядра-олигосахарида заменить. Однако, только молекулы LPS украшены третьим субединицей, известной как O-полисахарид, или O-антиген. Тип и количество гликолипидов, присутствующих будет влиять на плотность ОМ организма. Поэтому мы проверили, могут ли мембраны бактерий с разнообразным содержанием гликолипидов быть также изолированы с помощью нашей техники. Для LPS-производящих организмов, Salmonella enterica serovar Typhimurium и Escherichia coli, мембраны были легко изолированы и LPS O-антигена moiety не повлияло на расставание двухслойных. Acinetobacter baumannii производит молекулы LOS, которые имеют аналогичную массу O-антигена, недостаточное молекулы LPS; однако, мембраны этих микробов не могли первоначально быть разделены. Мы рассудили, что ОМ A. baumannii был менее плотным, чем у Enterobacteriaceae, поэтому градиент сахарозы был скорректирован и мембраны были изолированы. Таким образом, метод может быть адаптирован и модифицирован для использования с другими организмами.
Introduction
Грамотрицательные бактерии производят две мембраны, которые разделены периплазмическим пространством и пептидогликанской клеточной стенкой1. Внутренняя мембрана (IM) заключает цитозол и является симметричным двухслойным фосфолипидами. Пептидогликан защищает от тургорского давления и обеспечивает бактерию клеточной формой, а также крепится к внешней мембране (ОМ) липопротеинами2,,3. ОМ окружает периплазм и преимущественно асимметрично. Внутренняя листовка состоит из фосфолипидов и внешняя листовка состоит из гликолипидов, известных как липулигосахариды (LOS) или липополисахариды (LPS)4,5. Липидная асимметрия и биохимия молекул LOS/LPS во внешней листовке придают барьерные свойства поверхности клетки, которые защищают бактерию от опасностей в ее окружающей среде6,,7.
Молекулы LPS состоят из трех составляющих: липидный дизакчаролип, ядро олигосахарида и О-полисахарид или O-антиген. Липид А является умножить acylated disaccharolipid. Core-oligosaccharides состоят из 10-15 сахаров, известных как грубые LPS или R-LPS. Ядро подразделяется на внутреннюю область, состоящую из 2-кето-3-дезокси-D-манно-восьмилозоновой кислоты (кдо) и одного или нескольких остатков гептоза, а также внешней области, которая состоит, как правило, из гексосов (глюкоза или галактоза) и гептозов, или ацетамамидо сахара5. Область внешнего ядра более изменчива по своим компонентам и структуре, чем внутреннее ядро. В Salmonella spp., только одна основная структура была описана; однако, в Escherichia coli есть пять различных основных структур (обозначенных K-12, R1, R2, R3 и R4)8. E. coli K-12 DH5, который мы используем в этой процедуре несет мутации, что приводит к производству R-LPS9. Молекулы R-LPS не имеют O-антигена moiety и имеют аналогичный молекулярный вес молекул LOS.
Добавление O-антигена к R-LPS превращает эту молекулу в гладкую LPS, или S-LPS. O-антигены построены из коротких 3-4 углеводных субъединиц и состоят из нескольких методов с различной длиной цепи10. Некоторые LPS-производящих бактерий, как Salmonella enterica серовар Typhimurium (S. Typhimurium), дисплей тримодального распределения молекул LPS на их поверхности10,11. Очень длинная цепь O-антигенов может содержать более ста субъединиц и весить более ста килодальтонов. O-антигены обеспечивают поверхностные свойства бактерии, которые необходимы, чтобы противостоять антибиотикам, уклоняться от хипризавания бактериофагами, и вызывать болезни.
Виды Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria и другие генерируют молекулы ЛОС вместо молекул LPS на их поверхности12. Молекулы LOS состоят из липидов А и ядра олигосахаридов, но не хватает O-антигена. Эти типы грамотрицательных бактерий модифицировать их основные олигосахариды с дополнительными сахарами и комбинациями сахаров, чтобы изменить свойства поверхности12. Как LOS, так и LPS-производящие микробы произвностируют фосфаты на липидных и основных молекулах с катионными муатиами7. Эти дополнения включают фосфоэтаноламин, галактозамин и аминоарабиноззамены, которые функционируют путем нейтрализации анионического поверхностного заряда и тем самым защиты от катионных антимикробных пептидов. Грамотрицательные бактерии также изменить структуру ядра олигосахарида с переменной не-stoichiometric замены сахара, или дополнительные молекулы кдо, и изменить количество ацил цепи на липид-A disaccharolipids7.
Способность изолировать чат от ОМ Грам-отрицательных бактерий сыграла важную роль для понимания роли клеточной оболочки в устойчивости к противомикробным препаратам и патогенезаболезни 11,12. Выводы этого подхода были использованы для вывода механизмов сборки, обслуживания и реконструкции белка, фосфолипида и гликолипидов для ОМ.
Наша лаборатория регулярно выполняет бактериальные липидомные анализы для изучения белково-опосредованной липидной регуляции и липидной функции в различных грамотрицательных видов. Объемы, используемые в протоколе, отражают рутинное использование этой процедуры для анализа нерадиомаркированных фосфолипидов тонким слоем хроматографии и жидкой хроматографии тандемной масс-спектрометрии13,14.
Протокол начинается с разоблачения охлажденной подвески грамотрицательных бактерий к высокому осмолялярному раствору сахарозы и добавлению лизозима, чтобы отделить ОМ от основного пептидогликанского слоя (Рисунок 1)12. EDTA затем добавляется для облегчения проникновения лизозима, так как распущенный секвестр катионов нарушает боковое электростатическое взаимодействие между соседними молекулами LOS/LPS15. Первоначальный протокол, из которого был адаптирован наш, требовал образования сферопластов, грамотрицательных бактериальных клеток, которые состоят из плазменной мембраны и цитозола, но не имеют пептидогликанского слоя и ОМ. Не исключено, что сферопласты производятся адаптированным методом; однако, техника не полагается или предназначаю на их образовании для успеха. Вместо этого, лизозим-EDTA обработанные бактерии быстро собирают центрифугирование и повторно подвешены в сахарозный раствор меньшей концентрации перед давлением лизиса. OMs, которые могли бы быть освобождены путем формирования сферопластов, теоретически должны быть собраны из супернатантов обработанных клеток, но этот подход не подробно описан в настоящем. В конечном счете, обработанные клетки подвергаются обычной гомогенизации и лизис, что повышает эффективность и воспроизводимость процедуры разделения мембраны16.
После лизиса, общая мембраны собираются ультрацентрифугации и применяется к прерывистой сахарозы градиент плотности для фракции IM и Омс. Классический подход использует более непрерывный градиент, который состоит по крайней мере из пяти различных решений сахарозы11,12. Прерывистый градиент в нашем протоколе состоит из трех сахарозных растворов и разделов двухслойных на две отдельные фракции17. Молекулы LOS и LPS в пределах OMs Грам-отрицательных бактерий диск конверт для раздела в верхней коричневой низкой плотности IM фракции и нижней белой высокой плотности OM фракции(Рисунок 1 и рисунок 2).
Acinetobacter baumannii являются важными мультирезистентными человеческими патогенами, которые производят молекулы LOS в их ОМ и возводят клеточную оболочку, которую трудно отделить18,,19. Последние работы показывают, что производные протокола мы представляем здесь могут быть использованы для раздела двухслойных этих организмов20. Поэтому мы протестировали наш протокол на A. baumannii 17978. Первоначально эта процедура была неадекватной. Тем не менее, мы изменили концентрацию сахарозы раствора средней плотности и значительно улучшили разделение(рисунок 2). Тест NADH дегидрогеназы и LOS / LPS добычи и обнаружения процедура была использована для подтверждения разделения для A. baumannii, дикий тип S. Тифимурий и два O-антигена дефицитных энтеробактериальных генотипов; а именно, galE-мутант S. Тифимурий и лабораторный штамм, E. coli DH5 “(рисунок 3 и рисунок 4).
Цель этой работы заключается в обеспечении рационализированный подход для воспроизводимой изоляции мембран грамотрицательных бактерий. Протокол может быть использован для изучения многих типов мембранных молекул для этих микробов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод будет продолжать помогать исследователям в понимании роли клеточной оболочки в бактериальной физиологии и патогенеза. После последовательных ультрацентрриффирования шаги очищенной общей, внутренней и ОМ фракции могут быть получены. Эти мембраны могут быть анализированы ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была профинансирована P20GM10344 и R01AI139248, присужденными З.Д. Далебру.
Materials
| 1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene | VWR | 525-0466 | |
| 1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap | VWR | 10416-312 | |
| 2000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth | VWR | 10545-844 | |
| 4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well | BIORAD | 4561095 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer 10 mL | BIORAD | 1610747 | |
| 50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89049-174 | |
| 7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles | VWR | 71000-518 | |
| 70 mL polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter Life Sciences | 355622 | |
| Agar Powder | VWR | A10752 | |
| B10P Benchtop pH Meter with pH Probe | VWR | 89231-664 | |
| Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF – TOC (bench version) | ThermoFisher Scientific | 50136146 | |
| Benzonase Nuclease | MilliporeSigma | 70746-3 | |
| EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker | VWR | 4040-01 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin, Inc. | ||
| Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor | ThermoFisher Scientific | 75006526 | |
| Hydrochloric acid 6.0 N | VWR | BDH7204 | |
| IBI Scientific Orbital Platform Shaker | Fischer Scientific | 15-453-211 | |
| LB Broth Miller | VWR | 214906 | |
| Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade | VWR | VWRV0063 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | M2670 | |
| NADH | Sigma Aldrich | 10107735001 | |
| Optima XPN-80 – IVD | Beckman Coulter Life Sciences | A99839 | |
| Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS | Fischer Scientific | NC1624582 | |
| Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology | Sigma – Millipore | P4557 | |
| Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit | Thermofisher | 23238 | |
| Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Thermofisher | P20495 | |
| Proteacease -50, EDTA free | G Biosciences | 786-334 | |
| Proteinase K, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium hydroxide ≥99.99% | VWR | AA45780-22 | |
| Sorval RC 6 Plus Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 36-101-0816 | |
| Sucrose | MilliporeSigma | SX1075-3 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker | VWR | JT4109-6 | |
| Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 339160 | |
| Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm | Beckman Coulter Life Sciences | 344059 | |
| Vortex-Genie 2 | VWR | 102091-234 |
References
- Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).
- Egan, A. J., Vollmer, W. The physiology of bacterial cell division. Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).
- Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes. Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).
- Raetz, C. R. Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).
- Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
- Needham, B. D., Trent, M. S. Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).
- Simpson, B. W., Trent, M. S. Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences. Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).
- Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides. Frontiers in Microbiology. 9, 2153 (2018).
- Liu, D., Reeves, P. R. Escherichia coli K12 regains its O antigen. Microbiology. 140 (1), 49-57 (1994).
- Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen. FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).
- Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).
- Osborn, M. J., Munson, R. Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria. Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).
- Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia. Infection and Immunity. , (2019).
- Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia. Infection and Immunity. 86, (2018).
- Nikaido, H. Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances. Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).
- Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).
- Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).
- Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).
- Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability. Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).
- Kamischke, C., et al. The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane. Elife. 8, (2019).
