Scheiding van de celenvelop voor gramnegatieve bacteriën in binnen- en buitenste membraanfracties met technische aanpassingen voor Acinetobacter baumannii
Summary
Gram-negatieve bacteriën produceren twee ruimtelijk gescheiden membranen. Het buitenste membraan wordt van het binnenste membraan verdeeld door een periplasma en een peptidoglycanlaag. Het vermogen om de dubbele tweelagen van deze microben te isoleren is van cruciaal belang geweest voor het begrijpen van hun fysiologie en pathogenese.
Abstract
Deze methode werkt door het verdelen van de envelop van Gram-negatieve bacteriën in totaal, binnenste, en buitenste membraan (OM) fracties en eindigt met tests om de zuiverheid van de tweelagen te beoordelen. Het OM heeft een verhoogde totale dichtheid in vergelijking met het binnenste membraan, grotendeels te wijten aan de aanwezigheid van lipooligosachariden (LOS) en lipopolysachariden (LPS) in de buitenste bijsluiter. LOS en LPS moleculen zijn amphipathic glycolipids die een vergelijkbare structuur hebben, die bestaat uit een lipide-A disaccharolipide en core-oligosaccharide substituent. Echter, alleen LPS moleculen zijn versierd met een derde subeenheid bekend als de O-polysaccharide, of O-antigeen. Het type en de hoeveelheid aanwezige glycolipiden zullen de OM-dichtheid van een organisme beïnvloeden. Daarom hebben we getest of de membranen van bacteriën met een gevarieerd glycolgehalte op dezelfde manier kunnen worden geïsoleerd met behulp van onze techniek. Voor de LPS-producerende organismen, Salmonella enterica serovar Typhimurium en Escherichia coli, werden de membranen gemakkelijk geïsoleerd en had de LPS O-antigeenmoiety geen invloed op tweelaagse scheidingen. Acinetobacter baumannii produceert LOS moleculen, die een vergelijkbare massa hebben als O-antigeen deficiënte LPS moleculen; de membranen van deze microben konden echter aanvankelijk niet worden gescheiden. We redeneerden dat de OM van A. baumannii minder dicht was dan die van Enterobacteriaceae, dus de sacharosegradiënt werd aangepast en de membranen werden geïsoleerd. De techniek kan dus worden aangepast en aangepast voor gebruik met andere organismen.
Introduction
Gram-negatieve bacteriën produceren twee membranen die worden gescheiden door een periplasmische ruimte en een peptidoglycan celwand1. Het binnenste membraan (IM) omhult de cytosol en is een symmetrische tweelaag van fosfolipiden. Peptidoglycan beschermt tegen turgordruk en voorziet de bacterie van een celvorm en is bevestigd aan het buitenste membraan (OM) door lipoproteïnen2,3. Het OM omringt het periplasma en is overwegend asymmetrisch. De binnenste bijsluiter bestaat uit fosfolipiden en de buitenste bijsluiter bestaat uit glycolipiden bekend als lipooligosachariden (LOS) of lipopolysachariden (LPS)4,5. De lipideasymmetrie en de biochemie van de LOS/LPS-moleculen in de buitenste bijsluiter geven barrière-eigenschappen aan het celoppervlak die de bacterie beschermen tegen gevaren in zijn omgeving6,7.
LPS moleculen bestaan uit drie bestanddelen: de lipide A disaccharolipide, de kern oligosaccharide, en de O-polysaccharide of O-antigeen. Lipide A is een vermenigvuldig acylated disaccharolipide. Core-oligosachariden bestaan uit 10-15 suikers die bekend staan als ruwe LPS of R-LPS. De kern is onderverdeeld in het binnenste gebied, samengesteld uit 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonzuur (kdo) en een of meer heptoseresiduen, en een buitengebied dat over het algemeen bestaat uit hexoses (glucose of galactose) en heptoses, of paracetamolsuikers5. Het buitenste kerngebied is variabeler in zijn componenten en structuur dan de binnenste kern. In Salmonella spp., slechts een kernstructuur is beschreven; echter, in Escherichia coli zijn er vijf verschillende kernstructuren (aangewezen K-12, R1, R2, R3, en R4)8. E. coli K-12 DH5α, die we gebruiken in deze procedure draagt een mutatie die resulteert in de productie R-LPS9. De R-LPS moleculen missen de O-antigeen moiety en hebben een vergelijkbaar moleculair gewicht als LOS moleculen.
De toevoeging van O-antigeen aan R-LPS maakt van dit molecuul een gladde LPS, of S-LPS. De O-antigenen zijn opgebouwd uit korte 3-4 koolhydraatsubeenheden en bestaan uit meerdere modaliteiten met verschillende ketenlengtes10. Sommige LPS-producerende bacteriën, zoals Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), tonen een trimodale verdeling van LPS moleculen op hun oppervlak10,11. Zeer lange keten O-antigenen kunnen meer dan honderd subeenheden bevatten en meer dan honderd kilodaltons wegen. De O-antigenen bieden oppervlakte-eigenschappen aan de bacterie die nodig zijn om antibiotica te weerstaan, predatie te ontwijken door bacteriofagen en ziekte te veroorzaken.
Soorten Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria en anderen genereren LOS moleculen in plaats van LPS moleculen op hun oppervlak12. LOS moleculen bestaan uit lipide A en kern oligosachariden, maar missen het O-antigeen. Deze soorten gramnegatieve bacteriën wijzigen hun kernoligosachariden met extra suikers en combinaties van suikers om de oppervlakte-eigenschappen te veranderen12. Zowel LOS als LPS-producerende microben derivatize de fosfaten op lipide A en kernmoleculen met kationische moieties7. Deze toevoegingen omvatten fosfoethanolamine, galactosamine en aminoarabinose substitutie, die functioneren door het neutraliseren van anionische oppervlakte lading en daarmee te beschermen tegen kationische antimicrobiële peptiden. Gram-negatieve bacteriën wijzigen ook de kern oligosaccharide structuur met variabele niet-stoichiometrische vervangingen van suikers, of extra kdo moleculen, en veranderen het aantal acylketens op lipide-A disaccharolipiden7.
De mogelijkheid om het IM te isoleren van de OM van gram-negatieve bacteriën is instrumenteel geweest voor het begrijpen van de rol van de celenvelop in antimicrobiële resistentie en ziektepathogenese11,12. Afleidingen van deze aanpak zijn gebruikt om mechanismen van assemblage, onderhoud en remodelleren van het eiwit, fosfolipiden en glycolipid bestanddelen voor de OM af te leiden.
Ons lab voert routinematig bacteriële lipidomische analyses uit om eiwitgemedieerde lipideregulatie en lipidefunctie te bestuderen in een verscheidenheid van gramnegatieve soorten. De volumes die in het protocol worden gebruikt, weerspiegelen het routinematige gebruik van deze procedure om niet-radiolabelfolipiden te analyseren door dunne laagchromatografie en vloeibare chromatografie tandemmassaspectrometrie13,14.
Het protocol begint met het blootstellen van een gekoelde suspensie van Gram-negatieve bacteriën aan een hoge osmolar oplossing van sacharose en het toevoegen van lysozyme om de OM te scheiden van de onderliggende peptidoglycan laag (Figuur 1)12. EDTA wordt vervolgens toegevoegd om penetratie van de lysozyme te vergemakkelijken, omdat divalentkation kation equestration verstoort de laterale elektrostatische overbrugging interacties tussen aangrenzende LOS / LPS moleculen15. Het oorspronkelijke protocol waaruit de onze is aangepast vereiste de vorming van sferoplasten, een Gram-negatieve bacteriële celvorm die bestaat uit een plasmamembraan en cytosol, maar ontbreekt de peptidoglycan laag en een OM. Het is mogelijk dat sferoplasten worden geproduceerd volgens de aangepaste methode; echter, de techniek is niet afhankelijk of van plan op hun vorming voor succes. In plaats daarvan worden de met lysozyme-EDTA behandelde bacteriën snel geoogst door centrifugeren en opnieuw opgehangen in een sacharoseoplossing van mindere concentratie voordat ze onder druk staan. De OEM’s die kunnen zijn vrijgegeven door het vormen van sferoplasten moeten in theorie kunnen worden geoogst uit de supernatants van de behandelde cellen, maar deze aanpak is hierin niet gedetailleerd. Uiteindelijk worden de behandelde cellen onderworpen aan conventionele homogenisatie en lysis, wat de efficiëntie en reproduceerbaarheid van de membraanscheidingsprocedureverbetert 16.
Na lysis worden de totale membranen verzameld door ultracentrifugatie en toegepast op een discontinu sacharosedichtheidgradiënt om de OEM’s en OEM’s te fractioneren. De klassieke benadering maakt gebruik van een meer continue gradiënt die bestaat uit ten minste vijf verschillende sacharose oplossingen11,12. De discontinu gradiënt in ons protocol bestaat uit drie sacharoseoplossingen en verdeelt de tweelagen in twee verschillende breuken17. De LOS- en LPS-moleculen in de OEM’s van gramnegatieve bacteriën drijven de envelop naar een bovenste bruine IM-fractie met lage dichtheid en een lagere witte OM-fractie met hoge dichtheid(figuur 1 en figuur 2).
Acinetobacter baumannii zijn belangrijke multiresistente menselijke pathogenen die LOS moleculen produceren in hun OM en een celenvelop oprichten die moeilijk te scheiden is18,19. Recent werk suggereert dat een afleiding van het protocol dat we hier presenteren kan worden gebruikt om de tweelagen van deze organismen te verdelen20. Daarom hebben we ons protocol getest op A. baumannii 17978. Aanvankelijk was de procedure ontoereikend. We hebben echter de sacharoseconcentratie van de middendichtheidsoplossing gewijzigd en de scheiding aanzienlijk verbeterd(figuur 2). Een NADH dehydrogenase test en een LOS/LPS extractie- en detectieprocedure werden gebruikt om de scheiding voor A. baumannii, wild-type S te bevestigen. Typhimurium en twee O-antigeentekorten van enterobacteriële genotypen; namelijk galE-mutant S. Typhimurium en een laboratoriumstam, E. coli DH5α (figuur 3 en figuur 4).
De bedoeling van dit werk is om een gestroomlijnde aanpak te leveren voor het reproduceerend isoleren van de membranen van gramnegatieve bacteriën. Het protocol kan worden gebruikt om vele soorten membraan-geassocieerde moleculen voor deze microben te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze methode zal onderzoekers blijven helpen bij het begrijpen van de rol van de celenvelop in bacteriële fysiologie en pathogenese. Na de sequentiële ultracentrifugatiestappen kan een gezuiverd totaal-, binnen- en OM-fractie worden verkregen. Deze membranen kunnen afzonderlijk worden getest om hypothesen te testen met betrekking tot membraaneiwitlokalisatie en -functie, transport en handel over het periplasma en de samenstelling van de individuele tweelagen onder verschillende omgevingsomstandigheden. Biologische stud…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door P20GM10344 en R01AI139248 toegekend aan Z. D. Dalebroux.
Materials
| 1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene | VWR | 525-0466 | |
| 1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap | VWR | 10416-312 | |
| 2000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth | VWR | 10545-844 | |
| 4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well | BIORAD | 4561095 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer 10 mL | BIORAD | 1610747 | |
| 50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89049-174 | |
| 7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles | VWR | 71000-518 | |
| 70 mL polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter Life Sciences | 355622 | |
| Agar Powder | VWR | A10752 | |
| B10P Benchtop pH Meter with pH Probe | VWR | 89231-664 | |
| Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF – TOC (bench version) | ThermoFisher Scientific | 50136146 | |
| Benzonase Nuclease | MilliporeSigma | 70746-3 | |
| EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker | VWR | 4040-01 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin, Inc. | ||
| Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor | ThermoFisher Scientific | 75006526 | |
| Hydrochloric acid 6.0 N | VWR | BDH7204 | |
| IBI Scientific Orbital Platform Shaker | Fischer Scientific | 15-453-211 | |
| LB Broth Miller | VWR | 214906 | |
| Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade | VWR | VWRV0063 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | M2670 | |
| NADH | Sigma Aldrich | 10107735001 | |
| Optima XPN-80 – IVD | Beckman Coulter Life Sciences | A99839 | |
| Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS | Fischer Scientific | NC1624582 | |
| Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology | Sigma – Millipore | P4557 | |
| Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit | Thermofisher | 23238 | |
| Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Thermofisher | P20495 | |
| Proteacease -50, EDTA free | G Biosciences | 786-334 | |
| Proteinase K, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium hydroxide ≥99.99% | VWR | AA45780-22 | |
| Sorval RC 6 Plus Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 36-101-0816 | |
| Sucrose | MilliporeSigma | SX1075-3 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker | VWR | JT4109-6 | |
| Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 339160 | |
| Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm | Beckman Coulter Life Sciences | 344059 | |
| Vortex-Genie 2 | VWR | 102091-234 |
References
- Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).
- Egan, A. J., Vollmer, W. The physiology of bacterial cell division. Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).
- Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes. Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).
- Raetz, C. R. Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).
- Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
- Needham, B. D., Trent, M. S. Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).
- Simpson, B. W., Trent, M. S. Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences. Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).
- Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides. Frontiers in Microbiology. 9, 2153 (2018).
- Liu, D., Reeves, P. R. Escherichia coli K12 regains its O antigen. Microbiology. 140 (1), 49-57 (1994).
- Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen. FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).
- Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).
- Osborn, M. J., Munson, R. Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria. Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).
- Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia. Infection and Immunity. , (2019).
- Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia. Infection and Immunity. 86, (2018).
- Nikaido, H. Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances. Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).
- Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).
- Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).
- Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).
- Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability. Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).
- Kamischke, C., et al. The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane. Elife. 8, (2019).
