Изучение короткого пептидного адсорбции на растворе, рассеянном неорганических наночастицах с использованием метода истощения

Summary

Первым шагом в опонимание биомолекулы-неорганического взаимодействия твердых фаз является выявление фундаментальных физикохимических констант, которые могут быть оценены путем создания адсорбции изотермс. Адсорбция от жидкой фазы ограничена кинетикой, емкостью поверхности, рН и конкурентоспособной адсорбцией, которую все следует осторожно рассмотреть перед установкой эксперимента по адсорбции.

Abstract

Основы неорганических органических взаимодействий имеют решающее значение для открытия и разработки новых биоинтерфейсов, поддающимся использованию в биотехнологии и медицине. Недавние исследования показывают, что белки взаимодействуют с поверхностями через ограниченные сайты адсорбции. Фрагменты белка, такие как аминокислоты и пептиды, могут быть использованы для моделирования взаимодействия между сложными биологическими макромолекулами и неорганическими поверхностями. В течение последних трех десятилетий, многие действительные и чувствительные методы были разработаны для измерения физической химии основы этих взаимодействий: изотермальной титрации калореметрии (ITC), поверхностный плазмон резонанс (SPR), кварцевый кристаллический микробаланс (ККМ), общее внутреннее отражение флуоресценции (TIRF), и аттенированной общей спектроскопии отражения (ATR).

Самый простой и доступный метод измерения адсорбции – метод истощения, при котором вычисляется изменение концентрации сорбата (истощение) после контакта с рассеянным сорбентом, рассеянным раствором. Адсорбция изотермс, основанная на данных об истощении, обеспечивает все основные физикохимические данные. Однако адсорбция от решений требует более длительного времени уравновешенности из-за кинетической ограничения и сорбентов с высокой конкретной площадью поверхности, что делает его почти неприменимым к макроскопическим фиксированным поверхностям плоскости. Кроме того, при изучении адсорбирующих пептидов следует учитывать такие факторы, как нестабильность зол, агрегаты наночастиц, кристалличность сорбента, распределение размеров наночастиц, рН раствора и конкуренция за адсорбцию. Истощение данных является частью конструкции обеспечивает всеобъемлющие данные физической химии буквально для каждого растворимого сорбата, но остается наиболее доступной методологией, так как она не требует дорогостоящих населенных конструкций. В этой статье описывается базовый протокол экспериментального исследования пептидной адсорбции на неорганический оксид и охватывает все критические моменты, влияющие на процесс.

Introduction

За последние 50 лет взаимодействие неорганических поверхностей и пептидов привлекло большое внимание из-за его высокой важности в материаловедении и медицине. Биомедицинские исследования направлены на совместимость и стабильность биоинорганических поверхностей, которые имеют прямые последствия для регенеративной медицины, тканевой инженерии^1,,2,,3,и имплантации^4,,,5,6,7. Современные биочувствительные устройства, такие как датчики и приводы, основаны на функциональных белках, обездвижемых на оксидных полупроводниковых поверхностях^{88,9,,10,,11,,12,,13}. Современные методы очистки для производства белка часто полагаются на свойства взаимодействия биомолекулы в вниз по течению очистки и разделения^14.

Среди нескольких неорганических оксидов, диоксид титана остается наиболее часто используемым в сочетании с биологически значимыми субстратами^15,16. Исследования в области биоинтерфейсов на основе TiO₂были сосредоточены на установлении прочного и специфического связывания белков и пептидов без изменения их биологических и структурных свойств. В конечном счете, основной целью является высокая плотность поверхности слоя биомолекул с высокой стабильностью и повышенной функциональностью, которая будет способствовать созданию титана на основе биотехнологических и медицинских приложений¹⁷.

Титан и его сплавы широко используются в качестве хирургического материала имплантата, по крайней мере шесть десятилетий, потому что поверхность TiO₂ слой с толщиной в несколько нанометров коррозии устойчивы и экспонатов высокий уровень биосовместимости во многих in vivo приложений^18,19,20. Диоксид титана также широко считается неорганическим субстратом, производимым в биоминерализации, где нуклеация и неорганический фазовый рост, сопровождаемый белками и пептидами, могут обеспечить материалы с многообещающими каталитическими и оптическими свойствами^{21,22,,23,,24}.

Учитывая высокую актуальность взаимодействия между неорганическими материалами и биомолекулами в целом и белково-Тио₂ взаимодействий, в частности, было много исследований для решения манипуляции и контроля адсорбции белков на TiO₂. Благодаря этим исследованиям, некоторые фундаментальные свойства этого взаимодействия были выявлены, такие как адсорбция кинетики, поверхностного покрытия, и биомолекулы конформации, давая существенную поддержку для дальнейшего прогресса в биоинтерфейсах^5,13.

Однако, сложность протеина добавляет значительные ограничения на полное определение и понимание взаимодействия молекулярного уровня белка с неорганическими поверхностями. Предполагая, что биомолекулы взаимодействуют с неорганическими поверхностями через ограниченные участки, некоторые белки с известными структурами и аминокислотными последовательностями были сведены к их компонентам-пептидам и аминокислотам, которые изучаются отдельно. Некоторые из этих пептидов продемонстрировали значительную активность, что делает их уникальным предметом исследований адсорбции без необходимости предыдущего разделения белка^{25,26,27,28,29,30}.

Количественная характеристика пептидной адсорбции на ТиО₂ или других неорганических поверхностях может быть достигнута с помощью физических методов, которые были адаптированы специально для биомолекул в течение последних нескольких десятилетий. Эти методы включают в себя итермальной титрации калоремии (ITC), поверхностный плазмон резонанс (SPR), кварцевый кристалл микробаланс (ККМ), полное внутреннее отражение флуоресценции (TIRF), и ослабленной общей спектроскопии отражения (ATR),³¹все из которых позволяют обнаружить прочность адсорбции, предоставляя ключевые термодинамические данные:

Адсорбция биомолекул к неорганическому материалу может быть осуществлена двумя способами: 1) ЦМТ, а также метод истощения использования частиц, рассеянных в растворе, связывающем с фиксированными макроскопическими поверхностями; 2) SPR, ККМ, TIRF и ATR используют макроскопические поверхности, модифицированные неорганическим материалом, такими как стеклянные или металлические чипсы с золотым покрытием, кристаллы кварца, кристаллы сульфида цинка и чипы PMMA, соответственно.

Изотермальная калория титрации (ITC) является без этикетки физический метод, который измеряет тепло производится или потребляется при титроре растворов или неоднородных смесей. Чувствительные калориметрические клетки обнаруживают тепловые эффекты размером до 100 наноджоулей, что делает возможным измерение тепла адсорбции на поверхностях наночастиц. Тепловое поведение сорбата во время непрерывного добавления – титрования, обеспечивает полный термодинамический профиль взаимодействия выявление enthalpy, связывающей постоянной, и энтропии при заданной температуре^{32,33,34,35,36}.

Спектроскопия поверхностного плазмонного резонанса (SPR) представляет собой поверхностно-чувствительный оптический метод, основанный на измерении рефракционного индекса носителей в непосредственной близости от исследуемой поверхности. Это метод мониторинга обратимой адсорбции и толщины адсорбированного слоя в режиме реального времени и без этике. Связывающая константа может быть рассчитана из коэффициентов ассоциации и диссоциации. Эксперименты по адсорбции, проводимые при различных температурах, могут дать информацию о температурной зависимости энергии активации и последовательно других термодинамических параметров^37,,38,,39.

Метод микробаланса кварцевого кристалла измеряет изменение колеблющихся частот ыпизоэлектрических кристаллов во время процессов адсорбции и дезорпации. Связывающая константа может оцениваться по соотношению констант скорости адсорбции и desorption. ККМ используется для измерения относительной массы и, следовательно, не нуждается в калибровке^25,,27,,40. ККМ используется для адсорбции как из газа, так и из жидкости. Техника жидкости позволяет использовать цКМ в качестве инструмента анализа для описания осаждения на различных модифицированных поверхностях^41.

Полная внутренняя флуоресценция внутреннего отражения (TIRF) является чувствительной оптической межфалетовой техникой, основанной на измерении флуоресценции адсорбированных флюорофоров, возбужденных внутренне отраженными эвакуационными волнами. Метод позволяет обнаружить флуоресцентные молекулы, покрывающие поверхность толщиной на порядок в десятки нанометров, поэтому он используется при изучении макромолекулярного адсорбции на различных поверхностях^42,,43. На месте мониторинга динамики флуоресценции при адсорбции и desorption обеспечивают адсорбции кинетики и, следовательно, термодинамические данные^42,43.

Ослабленная общая отражательная лента (ATR) была использована Роддиком-Ланзилоттой для создания изотермов изазомерм изазомермизии лизиновых спектров на уровне 1600 и 1525 см^-1. Это первый случай, когда связывающая константа для пептида на TiO₂ была определена с помощью инфракрасного метода in situ⁴⁴. Этот метод был эффективен в создании асотермации для полилизиновых пептидов⁴⁵ и кислых аминокислот⁴⁶.

В отличие от вышеупомянутых методов, где параметр адсорбции измеряется на месте, в обычном эксперименте количество адсорбированных биомолекул измеряется изменением концентрации после того, как поверхность связалась с раствором. Поскольку концентрация сорбата распадается в подавляющем большинстве случаев адсорбции, этот метод называется методом истощения. Измерения концентрации требуют проверенного аналитического исследования, который может быть основан на внутреннее аналитическое свойство сорбата или на основе маркировки^{47,,48,,49,,50} или произвобления^51,,52 из них.

Эксперименты по адсорбции с использованием ККМ, SPR, TIRF или ATR требуют специальной подготовки поверхности чипов и датчиков, используемых для исследований адсорбции. Подготовленные поверхности должны использоваться один раз и требуют изменения при переключении адсорбата, в связи с неизбежным гидратации поверхности оксида или возможной chemisorption сорбата. Только один образец в то время может быть запущен с помощью ЦМТ, ККм, SPR, TIRF, или ATR, в то время как в методе истощения можно запустить десятки образцов, для которых количество ограничено только емкостью термостата и наличием сорбента. Это особенно важно при обработке больших выборочных партий или библиотек биологически активных молекул. Важно отметить, что метод истощения требует не дорогостоящего оборудования, а только термостата.

Однако, несмотря на очевидные преимущества, метод истощения требует сложных процедурных функций, которые могут показаться громоздкими. В этой статье представлено, как выполнить всеобъемлющее физико-химическое исследование дипептидного адсорбции на TiO₂ с использованием метода истощения и рассматриваются проблемы, с которыми исследователи могут столкнуться при проведении соответствующих экспериментов.

Protocol

1. Приготовление растворов дипептидных запасов и разбавлений Приготовление дипептидного раствора 16 мМ Поместите 0,183 г дипептида (Ile-His) (см. Таблица Материалов)в стерильной полимерной пробирке, разбавьте до 35 мл с двойной дистиллированной водой (DDW), и растворитесь при к…

Representative Results

Адсорбция дипептида на нанокристаллическом диоксиде титана изучалась в биосовместимых условиях в температурном диапазоне от 0 до 40 градусов по Цельсию. Экспериментальная дипептидная адсорпация (A, mmol/g) на поверхности диоксида титана <…

Discussion

Адсорбция от растворов для изотермовой конструкции требует более длительного времени для уравновешенности из-за кинетических ограничений и сорбентов с высокой специфической площадью поверхности. Кроме того, при адсадосировании аминокислот следует учитывать нестабильность зол, агр?…

Materials

2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid	TCI Chemicals	4432-31-9	MES, >98%
Acetonitrile	Panreac AppliChem		HPLC grade
Chromatography vials			glass
Dipeptide Ile-His	Bachem	4000894
Double-distilled water			DDW was obtained on spot
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD"	J.P. Selecta	3000865	5 L, 40 kHz, 120 Watts
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detector	Shimadzu, LC-20 Prominence		HPLC
Isopropanol	Sigma-Aldrich (Merck)	67-63-0	99.70%
LabSolutions Lite	Shimadzu	223-60410	Software for high-performance liquid chromatography system
Nanocrystalline TiO2			Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details.
Phenyl isothiocyanate	Acros Organics	103-72-0	PITC, 98%
Reversed-phase Zorbax column	ZORBAX LC		150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm
Syringe filter	Vladfilter		25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate
Test sterile polymeric tube			polypropylene
Thermostat TC-502	Brookfield		Refrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization
Triethylamine	Sigma-Aldrich (Merck)	121-44-8	TEA; 99%
Trifluoroacetic acid	Panreac AppliChem	163317	TFA, 99%