Imaging Dpp Liberación de un disco de ala Drosophila
Summary
El momento de la exposición a los ligandos puede afectar sus consecuencias en el desarrollo. Aquí mostramos cómo tomar imágenes de una proteína morfogenética ósea Drosophila (BMP) llamada Dpp de las células del disco del ala.
Abstract
La superfamilia transformadora de Factor de Crecimiento-beta (TGF-) es esencial para el patrón embrionario temprano y el desarrollo de estructuras adultas en organismos multicelulares. La superfamilia de TGF-o incluye TGF, proteína morfogenética ósea (BMP), Activinas, Factores de Crecimiento y Diferenciación, y Nodals. Durante mucho tiempo se ha sabido que la cantidad de ligando expuesto a las células es importante por sus efectos. Se pensó que los gradientes de concentración de largo alcance establecen un patrón embrionario. Sin embargo, recientemente ha quedado claro que el momento de la exposición a estos ligandos también es importante para sus consecuencias transcripcionales posteriores. Un ligando superfamiliar TGF-o no puede tener una consecuencia de desarrollo hasta que se libera de la célula en la que se produjo. Hasta hace poco, era difícil determinar cuándo estos ligandos se liberaban de las células. Aquí mostramos cómo medir la liberación de un BMP Drosophila llamado Decapentaplegic (Dpp) de las células del primordium del ala o disco de ala. Este método podría modificarse para otros sistemas o ligandos de señalización.
Introduction
Las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) son esenciales para la embriogénesis temprana y el patrón de las estructuras adultas. Los BMP se producen y secretan para afectar la transcripción de los genes diana necesarios para el crecimiento y la diferenciación celular en las células que responden. Decapentaplegic (Dpp) es un homólogo Drosophila de BMP4 que es importante para el desarrollo de estructuras embrionarias y adultas como el ala1,2,3,4. Varios grupos se han centrado en el papel de Dpp en el patrón de las alas de mosca adultas porque 1) las alas se componen de dos hojas de epitelia transparente con un patrón de venación consistente que se puede evaluar fácilmente; 2) los discos de alas también son razonablemente planos, se pueden cultivar fuera de la larva, y son fáciles de imaginar y cuantificar las diferencias en el patrón; y 3) el desarrollo del patrón de ala es sensible a Dpp de tal manera que pequeñas perturbaciones en la vía afectarán el patrón de venación del ala.
Dpp se produce en celdas situadas en el límite anterior/posterior del disco de ala5,6,7,8. Dpp se une a un complejo de tipo 1 y tipo 2 receptores de serina/threonina quinasa9,10. Tras la unión Dpp, el receptor tipo 2 fosforila el receptor tipo 1 que luego fosforila a las madres contra Dpp (Mad), un homólogo Smad 1/5/8. Phosphorylated SMAD recluta un co-Smad adicional (Medea), que le permite entrar al núcleo donde regula los genes diana, dando lugar a efectos aguas abajo como la proliferación o diferenciación4,11.
Recientemente, el Bates Lab ha demostrado que la liberación incorrecta de Dpp dentro del disco del ala puede conducir a una disminución en la fosforilación Mad, reducción en la expresión génica objetivo, y defectos de patrón de ala12,13. Varios canales iónicos impactan el desarrollo del ala Drosophila y las estructuras asociadas14,15. Estos canales iónicos también podrían estar involucrados en la versión Dpp. Al determinar el mecanismo de liberación de morógeno, es importante que haya un método para visualizar eventos de liberación.
Los doctores Aurelio Teleman y Stephen Cohen crearon una proteína de fusión Dpp-GFP que es capaz de rescatar la pérdida de Dpp, lo que significa que es biológicamente activa y se libera de una manera biológicamente relevante16. Aquí, describimos cómo visualizamos los eventos de lanzamiento de Dpp usando este Dpp-GFP. Esta proteína de fusión es particularmente útil porque GFP es sensible al pH de tal manera que cuando está en vesículas ácidas, la fluorescencia se afeita17. Por lo tanto, cuando una proteína etiquetada con GFP se libera de una vesícula en el entorno extracelular más neutro, la intensidad de la fluorescencia de GFP aumenta17. Aprovechamos la sensibilidad al pH de GFP para determinar si Dpp-GFP reside en vesículas ácidas. Hemos dado imágenes de discos de ala que expresan Dpp-GFP antes y después de la adición de cloruro de amonio, que neutraliza las vesículas de los compartimentos intracelulares18. Encontramos un aumento significativo en la fluorescencia de puncta después de la adición de cloruro de amonio, lo que sugiere que el Dpp-GFP intracelular se apadece antes de la adición de cloruro de amonio18. Concluimos que el Dpp-GFP intracelular reside en compartimentos ácidos ligados a la membrana, como vesículas, y no se quega al adicionar cloruro de amonio para neutralizar el pH de los compartimentos intracelulares18. Esto hace que la imagen en vivo de Dpp-GFP sea una técnica útil para visualizar la dinámica de Dpp en el disco de ala Drosophila a medida que se libera de los compartimentos ácidos en el entorno extracelular.
Aquí, describimos el método que usamos para visualizar eventos de lanzamiento de Dpp mediante Dpp-GFP. Dpp-GFP se puede expresar en su patrón nativo en discos de ala Drosophila utilizando el sistema UAS-GAL419. Este es el método que se utilizó para determinar que los canales Irk afectan a la versión18de Dpp. Validamos el método mediante pilas z de imágenes en vivo. No vemos Dpp-GFP puncta moviéndose dentro del plano de enfoque en series temporales si adquirimos en un plano de enfoque. Tampoco vemos el movimiento de Dpp-GFP puncta si pusimos una imagen en una pila z. Concluimos que el Puncta Dpp-GFP visto usando este método son eventos de liberación en lugar de movimiento de vesículas intracelularmente. Este método de imagen en vivo de Dpp-GFP podría utilizarse potencialmente para probar otros modificadores putativos de la liberación de Dpp para su impacto en la dinámica de Dpp o podría ser modificado para mirar la dinámica de otros ligandos
Protocol
Representative Results
Discussion
Los BMP como Dpp tienen un impacto significativo cuando se unen a un complejo de receptores unidos a la membrana para causar una cascada de señalización intracelular en células vecinas o aparentemente distantes. El laboratorio del Dr. Thomas Kornberg ha demostrado que las células que producen las células de contacto de señal Dpp que reciben la señal utilizando estructuras delgadas de filapodia basadas en actina llamadas citonmes15,24,<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Sarala Pradhan por trabajar en una versión anterior de este protocolo. Nos gustaría agradecer a NSF-IOS 1354282 por la financiación mientras desarrollamos este protocolo. Nos gustaría agradecer a NIH-NIDCR RO1DE025311 por financiar nuestro laboratorio actualmente.
Materials
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo. Development. 114 (3), 583-597 (1992).
- Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo. Development. 117 (2), 807-822 (1993).
- Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila. Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).
- Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary. Development. 113 (1), 27-33 (1991).
- Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. An extensive 3′ cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila. Development. 111 (3), 657-666 (1991).
- de Celis, J. F. Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing. Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Letsou, A., et al. Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family. Cell. 80 (6), 899-908 (1995).
- Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic. Cell. 78 (2), 225-237 (1994).
- Raftery, L. A., Sutherland, D. J. TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads. Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Dahal, G. R., et al. An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning. Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).
- George, L. F., et al. Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster. G3. 9 (4), 999-1008 (2019).
- Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
- Teleman, A. A., Cohen, S. M. Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc. Cell. 103 (6), 971-980 (2000).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Hazegh, K. E., Reis, T. A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic. Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332 (6027), 354-358 (2011).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Cytonemes as specialized signaling filopodia. Development. 141 (4), 729-736 (2014).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Communicating by touch–neurons are not alone. Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).
