ショウジョウバレウィングディスクからのイメージングDppリリース
Summary
リガンドへの暴露のタイミングは、発達の結果に影響を与える可能性があります。ここでは、翼ディスクの細胞からDppと呼ばれるショウジョウバエレベートタンパク質(BMP)の画像放出を行う方法を示す。
Abstract
形容形成長因子β(TGF-β)スーパーファミリーは、多細胞生物における初期胚パターン化および成人構造の開発に不可欠である。TGF-βスーパーファミリーには、TGF-β、骨形態形成タンパク質(BMP)、アクチビン、増殖および分化因子、および節点が含まれる。細胞に曝露されるリガンドの量は、その効果のために重要であることは長い間知られています。長距離濃度勾配が胚パターンを設定すると考えられた。しかし、最近では、これらのリガンドへの曝露のタイミングが、その下流の転写結果にも重要であることが明らかになりました。TGF-βスーパーファミリーリガンドは、それが産生された細胞から放出されるまで発達的な結果を持つことはできない。最近まで、これらのリガンドがいつ細胞から放出されたのか判断することは困難であった。ここでは、翼プリモルジウムまたは翼ディスクの細胞からデカペンタペラギック(Dpp)と呼ばれるショウジョウバエBMPの放出を測定する方法を示す。この方法は、他のシステムまたはシグナリングリガンドに対して変更することができます。
Introduction
骨形態形成タンパク質(BMP)は、成人構造の早期胚発生およびパターニングに不可欠です。BMPは、応答細胞の増殖および細胞分化に必要な標的遺伝子の転写に影響を与えるために産生され、分泌される。デカペンタペティック(Dpp)は、翼1、2、3、4のような胚および成人構造の発達に重要であるBMP4のショウジョウバレギである。いくつかのグループは、1)翼が簡単に評価することができる一貫したベナミズパターンを持つ2つの透明な上皮シートで構成されているため、大人のフライウィングのパターン化におけるDppの役割に焦点を当てています。2)翼ディスクも合理的に平らであり、幼虫の外で培養することができ、パターンの違いを画像化し、定量化することが簡単です。3)翼パターンの発達は、経路内の小さな摂動が翼の静脈パターンに影響を与えるようなDppに敏感である。
Dppは、翼ディスク5、6、7、8の前/後部境界に位置する細胞内で産生される。Dppは、タイプ1およびタイプ2セリン/スレオニンキナーゼ受容体9、10の複合体に結合する。Dpp結合時に、タイプ2受容体は、Dpp(マッド)に対して母親をリン酸化するタイプ1受容体をリン酸化し、スマッド1/5/8ホモログである。リン酸化SMADは、標的遺伝子を調節する核に入ることを可能にする追加の共スマド(Medea)を募集し、増殖または分化4、11などの下流効果をもたらす。
近年、ベイツラボは、翼ディスク内のDppの不適切な放出が、マッドリン酸化の減少、標的遺伝子発現の減少、および翼パターニング欠陥12、13につながる可能性があることを示している。いくつかのイオンチャネルは、ショウジョウバアラ翼および関連構造物14、15の発達に影響を与える。これらのイオンチャネルは、Dpp リリースにも関与する可能性があります。モルホゲン放出のメカニズムを決定する際には、リリースイベントを可視化する方法が重要です。
アウレリオ・テレマン博士とスティーブン・コーエン博士は、Dppの喪失を助得ることができるDpp-GFP融合タンパク質を作成し、生物学的に活性であり、生物学的に関連する方法で放出されることを意味する。ここでは、この Dpp-GFP を使用して Dpp リリース イベントを視覚化する方法について説明します。この融合タンパク質は、GFPが酸性小胞にある場合、蛍光が17を急行するようなpH感受性であるため、特に有用である。したがって、GFPでタグ付けされたタンパク質が小胞からより中性の細胞外環境に放出されると、GFP蛍光強度は17増加する。GFPのpH感度を利用して、Dpp-GFPが酸性小胞に存在するかどうかを判断しました。塩化アンモニウムを添加する前後にDpp-GFPを発現する翼ディスクを画像化し、小胞18の細胞内コンパートメントを中和する。塩化アンモニウムを添加した後のパンクタの蛍光の有意な増加を発見し、塩化アンモニウム18を添加する前に細胞内Dpp-GFPが急行されることを示唆した。我々は、細胞内Dpp-GFPが小胞などの酸性膜結合区画に存在し、塩化アンモニウムを添加すると、細胞内コンパートメント18のpHを中和するとアンカンチされると結論付ける。これにより、Dpp-GFPの生きたイメージングは、酸性コンパートメントから細胞外環境に放出されるショウジョウバアラウィングディスク内のDppのダイナミクスを可視化するのに有用な技術です。
ここでは、Dpp-GFP を使用して Dpp リリース イベントを視覚化するために使用する方法について説明します。Dpp-GFPは、UAS-GAL4システム19を使用してショウジョウバエウィングディスクにおけるそのネイティブパターンで表現することができる。これは、Irk チャネルが Dpp リリース18に影響を与えることを判断するために使用された方法です。z スタックをライブイメージングしてメソッドを検証しました。Dpp-GFP punctaが焦点の1つの平面で取得した場合、時系列の焦点の平面内で移動するのを見ていません。また、Zスタックで画像を作成した場合、Dpp-GFPパンクタの動きは見当たりません。我々は、この方法を用いて見られるDpp-GFPパンクタは、細胞内で小胞の動きではなく、放出事象であると結論付ける。Dpp-GFP のライブイメージングのこの方法は、Dpp ダイナミクスへの影響について Dpp リリースの他のポティティブ修飾子をテストするために使用される可能性があり、または他のリガンドのダイナミクスを調べるように変更できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
DppなどのBMPは、膜結合受容体の複合体を結合して、隣接する細胞または明らかに遠くの細胞で細胞内シグナル伝達のカスケードを引き起こす際に、その大きな影響を与えます。トーマス・コーンバーグ博士の研究室は、シトンメム15、24、25と呼ばれるアクチンベースの薄いフィラポディア様構造を用いてシグナルを受信するDppシグナル接触細胞…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロトコルの以前のバージョンに取り組んでくれたサララ・プラダン博士に感謝します。このプロトコルを開発している間、NSF-IOS 1354282の資金調達に感謝します。現在、NIH-NIDCR RO1DE025311にラボに資金を提供してくださったおかげで、私たちは感謝申し上げたいと思います。
Materials
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
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