Изображение Dpp Релиз из drosophila крыла диска
Summary
Сроки воздействия лигандов могут повлиять на их последствия для развития. Здесь мы покажем, как изображение выпуска drosophila кости морфогенетического белка (BMP) называется Dpp из клеток крыла диска.
Abstract
Трансформирующая сверхсемейная группа Фактор роста (TGF-я) имеет важное значение для раннего эмбрионального узорства и развития взрослых структур в многоклеточных организмах. Суперсемейка TGF-я включает в себя TGF-я, костяного морфогенетического белка (BMPs), активицинов, факторов роста и дифференциации, и нодаль. Давно известно, что количество лиганда, подвергаемого воздействию клеток, имеет важное значение для его воздействия. Считалось, что градиенты концентрации на длинных дистанциях создали эмбриональную модель. Однако в последнее время стало ясно, что сроки воздействия этих лиганд также имеет важное значение для их вниз по течению транскрипционных последствий. Суперсемейная лига н.е. TGF-я не может иметь следствие развития до тех пор, пока не высвобождается из клетки, в которой она была произведена. До недавнего времени было трудно определить, когда эти лиганды были освобождены из клеток. Здесь мы покажем, как измерить высвобождение Дрозофилы БМП под названием Decapentaplegic (Dpp) из клеток крыла примордия или диска крыла. Этот метод может быть изменен для других систем или сигнализации лигандов.
Introduction
Морфогенетические белки костей (БМП) необходимы для раннего эмбриогенеза и узорства взрослых структур. BMPs производятся и выделяются, чтобы повлиять на транскрипцию генов-мишеней, необходимых для роста и дифференциации клеток в ответных клетках. Decapentaplegic (Dpp) является Drosophila омолог БМП4, что важно для развития эмбриональных и взрослых структур, как крыло1,2,3,4. Несколько групп сосредоточили свое внимание на роли Dpp в узорчатом крыльях взрослых мух, потому что 1) крылья состоят из двух прозрачных листов эпителии с последовательной моделью venation, которые могут быть легко оценены; 2) диски крыла также разумно плоские, могут быть культивированы вне личинки, и просты для изображения и количественноразличия различий в шаблоне; и 3) развитие модели крыла чувствительно к Dpp так, что малые perturbations в тропе повлияют на картину venation крыла.
Dpp производится в клетках, расположенных в передней/ задней границе диска крыла5,6,7,8. Dpp связывается с комплексом типа 1 и типа 2 серина / трионин киназы рецепторов9,10. После Dpp связывания, тип 2 рецепторфориды типа 1 рецептор, который затем фосфорилаты матерей против Dpp (Mad), Smad 1/5/8 омолог. Фосфорилированный SMAD набирает дополнительный co-Smad (Медея), который позволяет ему войти в ядро, где он регулирует целевые гены, что приводит к вниз по течению эффекты, такие как распространение или дифференциация4,11.
Недавно, Бейтс Лаборатория показала, что ненадлежащее освобождение Dpp в крыло диска может привести к снижению Mad фосфорилирования, снижение экспрессии генов цели, и крыло шаблонных дефектов12,13. Несколько ионных каналов влияют на развитие крыла Дрозофилы и связанных с ним структур14,15. Эти ионные каналы также могут быть вовлечены в выпуск Dpp. При определении механизма высвобождения морфогена важно, чтобы был метод визуализации событий релиза.
Доктора Аурелио Телеман и Стивен Коэн создали белок синтеза Dpp-GFP, который способен спасти потерю Dpp, что означает, что он биологически активен и высвобождается биологически значимым образом16. Здесь мы описываем, как мы визуализировать события выпуска Dpp с помощью этого Dpp-GFP. Этот белок синтеза особенно полезен, потому что GFP является рН чувствительным таким образом, что, когда он находится в кислых пузырьков, флуоресценция закаляется17. Поэтому, когда белок, помеченный GFP, высвобождается из везикли в более нейтральную внеклеточную среду, интенсивность флуоресценции GFP увеличивается на17. Мы воспользовались чувствительностью pH GFP, чтобы определить, находится ли Dpp-GFP в кислых пузырьках. Мы изображения дисков крыла, выражающих Dpp-GFP до и после добавления хлорида аммония, который нейтрализует внутриклеточные отсеки пузырьков18. Мы обнаружили значительное увеличение флуоресценции пунктуры после добавления хлорида аммония, предполагая, что внутриклеточные Dpp-GFP затушевывается до добавления хлорида аммония18. Мы пришли к выводу, что внутриклеточные Dpp-GFP находится в кислых мембранных отсеков, таких как пузырьки, и не утоляется при добавлении хлорида аммония, чтобы нейтрализовать рН внутриклеточных отсеков18. Это делает живую визуализацию Dpp-GFP полезным методом визуализации динамики Dpp в диске крыла Drosophila, поскольку он высвобождается из кислых отсеков во внеклеточной среде.
Здесь мы описываем метод, который мы используем для визуализации событий выпуска Dpp с помощью Dpp-GFP. Dpp-GFP может быть выражен в его родной шаблон в drosophila крыла дисков с использованием системы UAS-GAL419. Это метод, который был использован, чтобы определить, что Irk каналы воздействия Dpp релиз18. Мы проверили метод с помощью живых изображений z-stacks. Мы не видим Dpp-GFP puncta движущихся в плоскости фокуса в временных рядах, если мы приобрели в одной плоскости фокуса. Мы также не видим движения Puncta Dpp-GFP, если мы изображены в z-стеке. Мы пришли к выводу, что пунктта Dpp-GFP, увиденная с помощью этого метода, является событиями высвобождения, а не движением пузырьков внутриклеточного. Этот метод живой визуализации Dpp-GFP потенциально может быть использован для тестирования других модификаторов dpp релиз для их воздействия на динамику Dpp или может быть изменен, чтобы посмотреть на динамику других лигандов
Protocol
Representative Results
Discussion
BMPs, такие как Dpp сделать их значительное влияние, когда они связывают комплекс мембранных связанных рецепторов, чтобы вызвать каскад внутриклеточной сигнализации в соседних или, видимо, далеких клеток. Лаборатория доктора Томаса Корнберга показала, что клетки, которые производят конта…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Саралу Прадхан за работу над более ранней версией этого протокола. Мы хотели бы поблагодарить NSF-IOS 1354282 за финансирование в то время как мы разработали этот протокол. Мы хотели бы поблагодарить NIH-NIDCR RO1DE025311 за финансирование нашей лаборатории в настоящее время.
Materials
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo. Development. 114 (3), 583-597 (1992).
- Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo. Development. 117 (2), 807-822 (1993).
- Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila. Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).
- Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary. Development. 113 (1), 27-33 (1991).
- Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. An extensive 3′ cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila. Development. 111 (3), 657-666 (1991).
- de Celis, J. F. Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing. Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Letsou, A., et al. Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family. Cell. 80 (6), 899-908 (1995).
- Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic. Cell. 78 (2), 225-237 (1994).
- Raftery, L. A., Sutherland, D. J. TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads. Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Dahal, G. R., et al. An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning. Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).
- George, L. F., et al. Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster. G3. 9 (4), 999-1008 (2019).
- Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
- Teleman, A. A., Cohen, S. M. Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc. Cell. 103 (6), 971-980 (2000).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Hazegh, K. E., Reis, T. A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic. Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332 (6027), 354-358 (2011).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Cytonemes as specialized signaling filopodia. Development. 141 (4), 729-736 (2014).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Communicating by touch–neurons are not alone. Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).
