एक Drosophila विंग डिस्क से इमेजिंग Dpp रिलीज
Summary
लिगन्ड्स के संपर्क में आने का समय उनके विकासात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकता है। यहाँ हम दिखाने के लिए कैसे एक Drosophila हड्डी morphogenetic प्रोटीन की छवि जारी करने के लिए (BMP) विंग डिस्क की कोशिकाओं से Dpp बुलाया.
Abstract
बहुकोशिकीय जीवों में वयस्क संरचनाओं के प्रारंभिक भ्रूण पैटर्न और विकास के लिए परिवर्तनकारी वृद्धि कारक-बीटा (टीजीएफ-जेड) सुपरफैमिली आवश्यक है। TGF– superfamily TGF-जेड, हड्डी morphogenetic प्रोटीन (BMPs), Activins, विकास और भेदभाव कारक, और नोडल शामिल हैं. यह लंबे समय से ज्ञात किया गया है कि कोशिकाओं को उजागर ligand की मात्रा इसके प्रभाव के लिए महत्वपूर्ण है. यह सोचा गया था कि लंबी दूरी की एकाग्रता ढाल भ्रूण पैटर्न की स्थापना की. तथापि, हाल ही में यह स्पष्ट हो गया है कि इन लिगंडों के संपर्क में आने का समय उनके डाउनस्ट्रीम ट्रांसक्रिप्शनल परिणामों के लिए भी महत्वपूर्ण है। एक TGF – superfamily ligand एक विकासात्मक परिणाम नहीं हो सकता जब तक यह सेल जिसमें यह उत्पादन किया गया था से जारी है. हाल ही में जब तक, यह निर्धारित करने के लिए जब इन ligands कोशिकाओं से जारी किए गए थे मुश्किल था. यहाँ हम दिखा कैसे विंग प्राइमोडियम या विंग डिस्क की कोशिकाओं से Decapentaplegic (Dpp) नामक एक Drosophila बीएमपी की रिहाई को मापने के लिए. इस विधि को अन्य प्रणालियों या संकेतligs के लिए संशोधित किया जा सकता है.
Introduction
अस्थि Morphogenetic प्रोटीन (BMPs) जल्दी भ्रूणजनन और वयस्क संरचनाओं के पैटर्न के लिए आवश्यक हैं. BMPs का उत्पादन कर रहे हैं और प्रतिक्रिया कोशिकाओं में विकास और सेल भेदभाव के लिए आवश्यक लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन को प्रभावित करने के लिए स्रावित. Decapentaplegic (Dpp) BMP4 का एक ड्रोसोफिला होमोलॉग है जो भ्रूणीय और वयस्क संरचनाओं जैसे विंग1,2,3,4के विकास के लिए महत्वपूर्ण है . कई समूहों वयस्क मक्खी पंखों पैटर्न में Dpp की भूमिका पर ध्यान केंद्रित किया है क्योंकि 1) पंख एक सुसंगत शिराविन्यास पैटर्न है कि आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है के साथ दो पारदर्शी एपिथेलिया शीट के शामिल हैं; 2) विंग डिस्क भी काफी फ्लैट हैं, लार्वा के बाहर सुसंस्कृत किया जा सकता है, और छवि के लिए सरल कर रहे हैं और पैटर्न में मतभेद मात्रा; और 3) विंग पैटर्न विकास Dpp के प्रति संवेदनशील है कि रास्ते में छोटे क्षोभ पंख वेशन पैटर्न को प्रभावित करेगा.
डीपीपी का उत्पादन विंग डिस्क5,6,7,8के पूर्ववर्ती/पश् च सीमा में स्थित कोशिकाओं में किया जाता है . Dpp प्रकार 1 के एक जटिल करने के लिए बांधता है और प्रकार 2 serine / threonine kinase रिसेप्टर्स9,10. Dpp बाइंडिंग पर, प्रकार 2 रिसेप्टर फॉस्फोरीलेट प्रकार 1 रिसेप्टर जो फिर Dpp के खिलाफ फॉस्फोरिलेट माताओं (मैड), एक Smad 1/ फॉस्फोरिलेटिड एसएमडी एक अतिरिक्त सह-स्माड (मेडिया) की भर्ती करता है, जो इसे नाभिक में प्रवेश करने में सक्षम बनाता है जहां यह लक्षित जीनों को नियंत्रित करता है, जिससे प्रसार या विभेद न होने जैसे डाउनस्ट्रीम प्रभाव4,11होते हैं।
हाल ही में, बैट्स लैब ने दिखाया है कि विंग डिस्क के भीतर डीपीपी की अनुचित रिहाई से मैड फॉस्फोरिलेशन में कमी, लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति में कमी और पंख पैटर्न दोष12,13हो सकते हैं। अनेक आयन चैनल द्रौपदी पक्ष और संबद्धसंरचनाओंके विकास को प्रभावित करते हैं. इन आयन चैनलों भी Dpp रिलीज में शामिल किया जा सकता है. morphogen रिलीज के तंत्र का निर्धारण करने में, यह महत्वपूर्ण है कि वहाँ एक विधि के लिए रिलीज की घटनाओं कल्पना है.
Drs. Aurelio Teleman और स्टीफन कोहेन एक Dpp-GFP संलयन प्रोटीन जो Dpp के नुकसान को बचाने में सक्षम है बनाया है, जिसका अर्थ है कि यह जैविक रूप से सक्रिय है और एक जैविक रूप से प्रासंगिक तरीके से जारी किया जाता है16. यहाँ, हम वर्णन कैसे हम Dpp रिलीज की घटनाओं इस Dpp-GFP का उपयोग कर कल्पना. यह संलयन प्रोटीन विशेष रूप से उपयोगी है क्योंकि जीएफपी पीएच संवेदनशील है जैसे कि जब यह अम्लीय vesicles में होता है, तो फ्लोरोसेंट17को बुझा दिया जाता है। इसलिए, जब GFP के साथ टैग प्रोटीन अधिक तटस्थ extracellular वातावरण में एक vesicle से जारी है, GFP फ्लोरोसेंट तीव्रता बढ़ जाती है17. हम GFP के पीएच संवेदनशीलता का लाभ उठाया निर्धारित करने के लिए अगर Dpp-GFP अम्लीय vesicles में रहता है. हमने अमोनियम क्लोराइड के अलावा डीपीपी-जीएफपी को व्यक्त करने वाली विंग डिस्क की छवि बनाई है, जो इंट्रासेल्यूलर डिब्बों vesicles18को बेअसर करती है। हमने अमोनियम क्लोराइड के अलावा के बाद पण्डक के फ्लोरेसेंट में उल्लेखनीय वृद्धि पाई, जिससे पता चलता है कि अमोनियम क्लोराइड18के अलावा इंट्रासेल्यूलर डीपीपी-जीपीपी को मज्जित किया जाता है। हम निष्कर्ष निकालते हैं कि इंट्रासेल्यूलर डीपीपी-जीएफपी अम्लीय झिल्ली से भरे डिब्बों में रहता है, जैसे वेसिकल्स, और इंट्रासेल्यूलर डिब्बों के पीएच को निष्क्रिय करने के लिए अमोनियम क्लोराइड के अलावा18। यह Dpp-GFP के लाइव इमेजिंग एक उपयोगी तकनीक Drosophila विंग डिस्क में Dpp की गतिशीलता कल्पना के रूप में यह extracellular वातावरण में अम्लीय डिब्बों से जारी है बनाता है.
यहाँ, हम विधि हम Dpp रिलीज की घटनाओं Dpp-GFP का उपयोग करने के लिए visualize करने के लिए उपयोग का वर्णन. Dpp-GFP UAS-GAL4 प्रणाली19का उपयोग कर Drosophila विंग डिस्क में अपने मूल पैटर्न में व्यक्त किया जा सकता है. यह Irk चैनल Dpp रिलीज़18को प्रभावित करता है कि यह निर्धारित करने के लिए उपयोग किया गया था जो विधि है। हमने लाइव-इमेजिंग z-स्टैक द्वारा विधि को मान्य किया है. हम Dpp-GFP puncta समय श्रृंखला में ध्यान के विमान के भीतर चलती नहीं देख अगर हम ध्यान के एक विमान में अधिग्रहण कर लिया. हम भी Dpp-GFP puncta के आंदोलन नहीं देख अगर हम एक z-स्टैक में छवि. हम निष्कर्ष है कि Dpp-GFP puncta इस विधि का उपयोग कर देखा घटनाओं के बजाय vesicles intracellularly के आंदोलन जारी कर रहे हैं. Dpp-GFP के लाइव-इमेजिंग की इस विधि संभावित Dpp गतिशीलता पर उनके प्रभाव के लिए Dpp रिलीज के अन्य putative संशोधक परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या अन्य ligands की गतिशीलता को देखने के लिए संशोधित किया जा सकता
Protocol
Representative Results
Discussion
ऐसे Dpp के रूप में BMPs उनके महत्वपूर्ण प्रभाव बनाने के लिए जब वे झिल्ली बाध्य रिसेप्टर्स के एक जटिल बाँध पड़ोसी या जाहिरा तौर पर दूर की कोशिकाओं में intracellular संकेतन का एक झरना पैदा करने के लिए. डॉ थॉमस Kornberg की प्र?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस प्रोटोकॉल के पूर्व संस्करण पर काम करने के लिए डा सरला प्रधान को धन्यवाद देना चाहेंगे। हम इस प्रोटोकॉल विकसित करते समय वित्त पोषण के लिए एनएसएफ-आईओएस 1354282 को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम NIH-NIDCR RO1DE025311 वर्तमान में हमारी प्रयोगशाला के वित्तपोषण के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
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