Imaging Dpp Release von einer Drosophila Wing Disc
Summary
Der Zeitpunkt der Exposition gegenüber Liganden kann sich auf ihre Entwicklungsfolgen auswirken. Hier zeigen wir, wie man die Freisetzung eines Drosophila-Knochenmorphogenetischen Proteins (BMP) namens Dpp aus Zellen der Flügelscheibe abbilden kann.
Abstract
Die transformierende Überfamilie des Wachstumsfaktor-Betas (TGF-)ist für die frühe embryonale Musterung und Entwicklung von adulten Strukturen in mehrzelligen Organismen unerlässlich. Die TGF–Überfamilie umfasst TGF-, Knochenmorphogenetisches Protein (BMPs), Activine, Wachstums- und Differenzierungsfaktoren und Nodals. Es ist seit langem bekannt, dass die Menge an Liganden, die Zellen ausgesetzt sind, für seine Wirkung wichtig ist. Es wurde angenommen, dass weiträumige Konzentrationsgradienten embryonale Muster aufstellen. In jüngster Zeit wurde jedoch deutlich, dass der Zeitpunkt der Exposition gegenüber diesen Liganden auch für ihre nachgelagerten Transkriptionsfolgen wichtig ist. Ein TGF–A-Superfamilienligand kann keine Entwicklungsfolge haben, bis es aus der Zelle, in der es hergestellt wurde, freigesetzt wird. Bis vor kurzem war es schwierig zu bestimmen, wann diese Liganden aus Zellen freigesetzt wurden. Hier zeigen wir, wie man die Freisetzung eines Drosophila BMP namens Decapentaplegic (Dpp) aus den Zellen des Flügelprimordiums oder der Flügelscheibe misst. Diese Methode kann für andere Systeme oder Signalligaden geändert werden.
Introduction
Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sind für die frühe Embryogenese und Musterung von erwachsenen Strukturen unerlässlich. BMPs werden produziert und abgesondert, um die Transkription von Zielgenen zu beeinflussen, die für das Wachstum und die Zelldifferenzierung in reagierenden Zellen benötigt werden. Decapentaplegic (Dpp) ist ein Drosophila Homolog von BMP4, das für die Entwicklung von embryonalen und erwachsenen Strukturen wie dem Flügel1,2,3,4wichtig ist. Mehrere Gruppen haben sich auf die Rolle von Dpp bei der Musterung von erwachsenen Fliegenflügeln konzentriert, da 1) die Flügel aus zwei transparenten Epithelia-Blättern mit einem konsistenten Venationsmuster bestehen, das leicht beurteilt werden kann; 2) die Flügelscheiben sind auch einigermaßen flach, können außerhalb der Larve kultiviert werden und sind einfach zu bilden und zu quantifizieren Unterschiede im Muster; und 3) die Flügelmusterentwicklung ist empfindlich gegenüber Dpp, so dass kleine Störungen im Weg flügelvenationsmuster beeinflussen.
Dpp wird in Zellen in der vorderen/hinteren Grenze der Flügelscheibe5,6,7,8produziert. Dpp bindet an einen Komplex von Typ 1 und Typ 2 Serin/Threonin-Kinase-Rezeptoren9,10. Bei Dpp-Bindung phosphorisiert der Typ-2-Rezeptor den Typ-1-Rezeptor, der dann Mütter gegen Dpp (Mad), einen Smad 1/5/8 Homolog, phosphoryliert. Phosphorylierte SMAD rekrutiert einen zusätzlichen Co-Smad (Medea), der es ermöglicht, in den Kern einzutreten, wo es Zielgene reguliert, was zu nachgelagerten Effekten wie Proliferation oder Differenzierung4,11führt.
Kürzlich hat das Bates Lab gezeigt, dass die unsachgemäße Freisetzung von Dpp innerhalb der Flügelscheibe zu einer Abnahme der Mad-Phosphorylierung, einer Verringerung der Zielgenexpression und Flügelmusterdefekten12,13führen kann. Mehrere Ionenkanäle beeinflussen die Entwicklung des Drosophila-Flügels und der zugehörigen Strukturen14,15. Diese Ionenkanäle könnten auch an der Dpp-Veröffentlichung beteiligt sein. Bei der Bestimmung des Mechanismus der Morphogenfreisetzung ist es wichtig, dass es eine Methode gibt, um Freisetzungsereignisse zu visualisieren.
Drs. Aurelio Teleman und Stephen Cohen schufen ein Dpp-GFP-Fusionsprotein, das in der Lage ist, den Verlust von Dpp zu retten, was bedeutet, dass es biologisch aktiv ist und auf biologisch relevante Weise freigesetzt wird16. Hier beschreiben wir, wie wir Dpp-Release-Ereignisse mit diesem Dpp-GFP visualisieren. Dieses Fusionsprotein ist besonders nützlich, da GFP pH-empfindlich ist, so dass, wenn es in sauren Vesikeln ist, die Fluoreszenz abgeschreckt wird17. Wenn also ein mit GFP markiertes Protein aus einem Vesikel in die neutralere extrazelluläre Umgebung freigesetzt wird, erhöht sich die GFP-Fluoreszenzintensität um17. Wir nutzten die pH-Empfindlichkeit von GFP, um festzustellen, ob Dpp-GFP in sauren Bläschen liegt. Wir abgebildetflügelförmige Nvenzen, die Dpp-GFP vor und nach dem Zusatz von Ammoniumchlorid ausdrücken, das intrazelluläre Kompartimente neutralisiert18. Wir fanden eine signifikante Zunahme der Fluoreszenz von Punktikern nach der Zugabe von Ammoniumchlorid, was darauf hindeutet, dass intrazelluläres Dpp-GFP vor der Zugabe von Ammoniumchlorid18abgeschreckt wird. Wir schlussfolgern, dass sich intrazelluläres Dpp-GFP in sauren membrangebundenen Kompartimenten wie Vesikeln befindet und nach Zugabe von Ammoniumchlorid unausgequetscht wird, um den pH-Wert der intrazellulären Kompartimente zu neutralisieren18. Dies macht die Live-Bildgebung von Dpp-GFP zu einer nützlichen Technik, um die Dynamik von Dpp in der Drosophila-Flügelscheibe zu visualisieren, da sie aus sauren Kompartimenten in die extrazelluläre Umgebung freigesetzt wird.
Hier beschreiben wir die Methode, mit der wir Dpp-Release-Ereignisse mit Dpp-GFP visualisieren. Dpp-GFP kann in seinem nativen Muster in Drosophila Flügelscheiben mit dem UAS-GAL4 System19ausgedrückt werden. Dies ist die Methode, die verwendet wurde, um zu bestimmen, dass Irk-Kanäle Dpp-Version18beeinflussen. Wir validierten die Methode durch Live-Imaging-Z-Stacks. Wir sehen nicht, dass sich Dpp-GFP puncta innerhalb der Fokusebene in Zeitreihen bewegt, wenn wir in einer Fokusebene erworben werden. Wir sehen auch keine Bewegung von Dpp-GFP puncta, wenn wir in einem Z-Stack abgebildet sind. Wir schlussfolgern, dass die Dpp-GFP-Punktias, die mit dieser Methode beobachtet werden, Freisetzungsereignisse sind und nicht die Intrazellulärbewegung von Vesikeln. Diese Methode der Live-Imaging von Dpp-GFP könnte möglicherweise verwendet werden, um andere vermeintliche Modifikatoren der Dpp-Freisetzung auf ihre Auswirkungen auf die Dpp-Dynamik zu testen, oder könnte geändert werden, um die Dynamik anderer Liganden zu betrachten.
Protocol
Representative Results
Discussion
BMPs wie Dpp machen ihre signifikante Wirkung, wenn sie einen Komplex von membrangebundenen Rezeptoren binden, um eine Kaskade von intrazellulären Signalisierung in benachbarten oder scheinbar entfernten Zellen zu verursachen. Das Labor von Dr. Thomas Kornberg hat gezeigt, dass Zellen, die die Dpp-Signalkontaktzellen erzeugen, die das Signal mit actinbasierten dünnen Filapodie-ähnlichen Strukturen empfangen, die Zytome15,24,25</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Dr. Sarala Pradhan für die Arbeit an einer früheren Version dieses Protokolls danken. Wir möchten NSF-IOS 1354282 für die Finanzierung danken, während wir dieses Protokoll entwickelt haben. Wir danken NIH-NIDCR RO1DE025311 für die Finanzierung unseres Labors.
Materials
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
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