ヒト羊膜の異なる解剖学的領域からの上皮細胞のインビトロ培養
1Departamento de Fisiología y Desarrollo Celular,Instituto Nacional de Perinatología, 2Biotecnología Médica y Farmacéutica CONACYT,Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ), 3Departamento de Inmunobioquímica,Instituto Nacional de Perinatología, 4Instituto de Neurobiología, UNAM
Summary
このプロトコルは、ヒト羊膜の異なる解剖学的領域からの上皮細胞の単離を記述し、臨床および生理学的病理学モデルにおける可能な適用のための異質性および機能的特性を決定する。
Abstract
ヒト羊膜上皮細胞(HAEC)の単離および培養のための文献にはいくつかのプロトコルが報告されている。しかしながら、これらは羊膜上皮が均質な層であると仮定する。ヒト羊膜は、反射、胎盤、臍の3つの解剖学的領域に分けることができる。各領域は、病理学的状態などで異なる生理学的役割を有する。ここでは、ヒト羊膜組織を3つのセクションで解剖し、インビトロで維持するプロトコルについて説明する。培養では、反射した羊膜に由来する細胞は立方体形態を示し、胎盤領域と臍領域の両方の細胞は扁平上皮であった。それにもかかわらず、得られた全ての細胞は上皮表現型を有し、E−カドヘリンの免疫検出によって実証される。したがって、その場での胎盤領域と反射領域は細胞成分と分子機能が異なるため、IN vitro試験ではHAECの使用に生理的な影響を及ぼす可能性があるため、これらの違いを考慮する必要がある場合があります。生物医学研究と再生医療におけるこれらの細胞の有望な応用
Introduction
ヒト羊膜上皮細胞(HAEC)は、胚発生の初期段階で、約8日後の受精で生じる。それらは、羊膜1の最も内側の層から派生するエピブラストの扁平上皮細胞の集団から生じる。従って、HAECは、胚2の3つの生殖層に分化する可能性を有するエピブラスト由来の多能性細胞の残骸と考えられる。過去10年間に、多様な研究グループは、これらの細胞を妊娠期の羊膜から分離し、インビトロ3、4の培養モデルにおける推定多能性関連特性を特徴付ける方法を開発した。
従って、表面抗原SSEA-3、SSEA-4、TRA 1-60、TRA 1-81などのヒト多能性幹細胞(HPSC)のHAEC特徴特性が判明した。多能性転写因子OCT4、SOX2、およびNANOGのコア;増殖マーカーKI67は、それらが自己更新していることを示唆する5、6、7。さらに、これらの細胞は、3つの生殖層(外胚葉、中胚葉、内胚葉)の系統特異的マーカーに対して陽性の細胞を得るために分化プロトコルを用いて挑戦されてきた4、5、8、ならびにヒト疾患の動物モデルにおいて。最後に、HAECエクスプレスE-カドヘリンは、HPSC5、9と同様に上皮的な性質を保持していることを実証します。
胚起源とは別に、HAECは、抗炎症分子および抗菌分子10、11、成長因子およびサイトカイン放出12の分泌、HPSC2とは対照的に免疫不全マウスに移植された場合の奇形腫の形成、および免疫学的耐性など、異なる臨床用途に適した他の本質的特性を有する。移植13.
しかし、これまでの報告では、ヒト羊膜は同種の膜であると仮定しており、解剖学的および生理学的に3つの領域に分けられることを考慮せずに:胎盤(デシドゥア基底を覆う羊膜)、臍帯(臍帯を包む部分)、および反射(膜の残りの部分は胎盤に付着していない)14。羊膜の胎盤および反射領域は、形態、ミトコンドリア活性、活性酸素種15の検出、miRNA発現16、およびシグナル伝達経路17の活性化における変化を示すことを示している。これらの結果は、ヒト羊膜が異なる機能を有する異種集団によって統合され、その結果またはインビトロモデルのいずれかで行われるさらなる研究のために考慮されるべきであることを示唆している。他の研究室は、膜全体からHAECを分離するためのプロトコルを設計していますが、我々の研究室は、異なる解剖学的領域から細胞を分離、培養、および特徴付けるプロトコルを確立しました。
Protocol
このプロトコルは、メキシコシティのナシオナル・デ・ペリナトロジアの倫理委員会によって承認されました(レジストリ番号212250-21041)。これらの研究で行われたすべての手順は、ナシオナル・デ・ペリナトロジーア内科学会の倫理基準、ヘルシンキ宣言、および保健省の公式メキシコ規格に定められたガイドラインに従っていました。 1. 準備 EDTAで1x PBSの溶液を…
Representative Results
HAECは、羊膜の3つの解剖学的領域のそれぞれから単離し、インビトロで個別に培養した。48時間培養した後、上皮表現型を有する細胞がプレートの表面に付着し、培地には細胞破片や浮遊細胞も含まれていたが、培地が変化すると除去した(図3)。 一次培養(通路ゼロ、P0)の処理中に、実験データ分析を妨げる可能性のあるいくつかの合併症が生じる可…
Discussion
HAECを用語膜から分離する新しいプロトコルを実装した。各膜は、各膜から細胞を分析するために分離する前に、その3つの解剖学的領域に分割されたという点で、以前の報告とは異なります。
プロトコルの最も重要なステップの1つは、上皮細胞を分離する際にトリプシンの活性を妨げる可能性があるため、すべての血栓を除去する膜の洗浄である。このステップを適切?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちの研究は、インスティトゥート・ナシオナル・デ・ペリナトリオ・デ・メヒコ(21041年と21081年)とCONACYT(A1-S-8450および252756)からの助成金によって支援されました。ジェシカ・ゴンサレス・ノリスとリディア・ユーリリア・パレデス・ビヴァスのテクニカルサポートに感謝します。
Materials
| Culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Supplemented with high glucose and HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0.5 M |
| Embryonic stem-cell FBS, qualified | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldehyde | any brand | ||
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Saline solution (sodium chloride 0.9%) | any brand | ||
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Disposable material | |||
| 100 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3516 | |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | |||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Centrifuge | |||
| Micropipettes | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Sterile beakers of 500 mL | |||
| Sterile plastic cutting board | |||
| Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps | |||
| Sterile stainless steel container | |||
| Sterile tray | |||
| Tube Rotator | MaCSmix | ||
| Antibodies and Kits | Antibody ID | ||
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Cell Signaling | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | Cell Signaling | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Tunel Assay Kit | Abcam | 66110 |
References
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Cite This Article
Avila-González, D., García-López, G., Díaz-Martínez, N. E., Flores-Herrera, H., Molina-Hernández, A., Portillo, W., Díaz, N. F. In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane. J. Vis. Exp. (153), e60551, doi:10.3791/60551 (2019).