Apoptos induktion och detektion i en primär kultur av hav gurka tarmceller
Summary
Detta protokoll ger en lätt att hantera metod för att odla tarmcellerna från sjögurka Apostichopus japonicus och är kompatibel med en mängd olika allmänt tillgängliga vävnadsprover från marina organismer, inklusive ECHINODERMATA, Mollusca, och Crustacea.
Abstract
Primära odlade celler används i en mängd olika vetenskapliga discipliner som exceptionellt viktiga verktyg för funktionell utvärdering av biologiska substanser eller karakterisering av specifika biologiska aktiviteter. Men på grund av bristen på universellt tillämpliga cellkultur medier och protokoll, väl beskrivna cell odlingsmetoder för marina organismer är fortfarande begränsade. Under tiden hämmar den vanligast förekommande mikrobiella föroreningen och de polytropiska egenskaperna hos Marina ryggradslösa celler ytterligare inrättandet av en effektiv cellkultur strategi för Marina ryggradslösa djur. Här beskriver vi en lätt att hantera metod för odling av tarmceller från sjögurka Apostichopus japonicus; Dessutom, vi ger ett exempel på in vitro-apoptos induktion och detektion i primära odlade tarmceller. Dessutom ger detta experiment information om lämplig odlingsmedium och cellinsamlingsmetod. Det beskrivna protokollet är förenligt med en mängd allmänt tillgängliga vävnadsprover från marina organismer, inklusive ECHINODERMATA, Mollusca och Crustacea, och det kan ge tillräckliga celler för flera in vitro-experimentella tillämpningar. Denna teknik skulle göra det möjligt för forskare att effektivt manipulera primär cellkulturer från Marina ryggradslösa djur och att underlätta funktionell utvärdering av riktade biologiska material på celler.
Introduction
Odling av celler under artificiellt kontrollerade betingelser, och inte i deras naturliga miljö, ger enhetliga experimentella material för biologiska studier, särskilt för arter som inte lätt kan odlas i laboratoriemiljö. Marina ryggradslösa djur står för mer än 30% av alla djurarter1, och de tillhandahåller många biologiska material för att bedriva forskning om regleringsmekanismerna för specifika biologiska processer, såsom Regeneration2,3, stress svar4och miljöanpassning5,6.
Sjögurka, apostichopus japonicus, är en av de mest studerade artikel om arter som lever tempererade vatten längs Norra Stillahavskusten. Det är välkänt som en kommersiellt viktig art och mariculodlade i stor skala i Östasien, särskilt i Kina7. Många vetenskapliga frågor om A. japonicus, inklusive de reglerande mekanismerna bakom intestinal förnyelse efter urtagning8 och degeneration i aestivation9, metabolisk kontroll10,11, och immunsvar12,13 under termiska eller patogena spänningar, har uppmärksammats av forskare. Men jämfört med väl studerade modell djur, grundforskning, särskilt på cellnivå, begränsas av tekniska flaskhalsar, såsom avsaknaden av avancerade metoder cellodling.
Forskare har ägnat mycket arbete åt att etablera cellinjer, men de har också stått inför många utmaningar och ingen cellinjer från några Marina ryggradslösa djur har etablerats ännu14. Men primära cellkulturer från Marina ryggradslösa djur har avancerat i senaste decennierna15,16, och de har gett en möjlighet för experiment på cellnivå. Till exempel, den regenererande intesine från A. japonicus har utnyttjats som en källa till celler för långsiktiga cellkulturer som gav en praktisk metod för primär cellkultur av Marina ryggradslösa djur17. Detta protokoll kombinerade och optimerade strategier för ryggradslösa cellkulturer och utvecklade en allmänt lämplig primär kultur metod för sjögurka eller andra ryggradslösa marina djur.
Apoptos är en inneboende cell självmord program som utlöses av olika exogena och endogena stimuli. Koordinerad apoptos är avgörande för många biologiska system18,19, och det har varit inblandad i intestinal regression av sjögurka under aestivation9. För att undersöka den apoptotiska processen i organismer av intresse, en rad metoder, inklusive Hoechst färgning och mikroskopi analyser, har upprättats och framgångsrikt tillämpas20. Här genomförde vi apoptos induktion och detektion i primära odlade tarmceller av sjögurka för att bedöma användbarheten av primära celler i biologiska studier av Marina ryggradslösa djur. Dexametason, en av de vanligaste syntetiska glukokortikosteroiderna21, användes för att inducera apoptos i odlade tarmceller från sjögurka, och betydande Hoechst 33258 signal framgångsrikt upptäcktes i de färgade cellerna av fluorescerande mikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Omfattande forskningsinsatser har ägnats åt att etablera cellinjer under de senaste decennierna, men det är fortfarande svårt att göra framsteg på långsiktig kultur av celler från Marina ryggradslösa djur14,22. Det har rapporterats att odlade celler från regenererande holothurian vävnader var livskraftiga under en lång tidsperiod och hög aktivitet av proliferation kan upptäckas i specifika celler17,<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka prof. Naiming Zhou från Zhejiang universitet för hans tekniska råd och för att göra utrustningen av hans laboratorium tillgängliga för användning. Detta arbete stöddes ekonomiskt av National Natural Science Foundation i Kina (Grant nummer 41876154, 41606150 och 41406137) och de grundläggande forskningsfonderna för Zhejiang provinsiella universitet och forskningsinstitut [Grant Number 2019JZ00007 ].
Materials
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
References
- Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).
- Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers. Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).
- Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis. Bmc Genomics. 17, 718 (2016).
- Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816). Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).
- Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas). Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).
- Han, G., Zhang, S., Dong, Y. Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction. Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).
- Zhang, X., et al. The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration. PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).
- Sun, L., et al. iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).
- Xu, K., et al. Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).
- Yang, H. S., et al. Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).
- Xiang, X. W., et al. Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses. Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).
- Jiang, L., et al. A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus. International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).
- Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database. Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).
- Cai, X., Zhang, Y. Marine invertebrate cell culture: a decade of development. Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).
- Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons. Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).
- Pinsino, A., Alijagic, A. Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions. Biology Open. 8 (3), (2019).
- Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures. Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).
- Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity. Excli Journal. 8, 155-181 (2009).
- Wan, L., et al. Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits. Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).
- Kasibhatla, S., et al. Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).
- Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes. Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).
- Rinkevich, B. Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness. Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).
- Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues. Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).
- Yu, H., et al. Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka). Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).
