Induction et détection d'apoptosis dans une culture primaire des cellules intestinales de concombre de mer
Summary
Ce protocole fournit une méthode facile à manipuler pour la culture des cellules intestinales du concombre de mer Apostichopus japonicus et est compatible avec une variété d’échantillons de tissus largement disponibles provenant d’organismes marins, y compris Echinodermata, Mollusca et Crustacea.
Abstract
Les cellules cultivées primaires sont utilisées dans une variété de disciplines scientifiques comme outils exceptionnellement importants pour l’évaluation fonctionnelle des substances biologiques ou la caractérisation d’activités biologiques spécifiques. Cependant, en raison de l’absence de médias et de protocoles de culture cellulaire universellement applicables, les méthodes de culture cellulaire bien décrites pour les organismes marins sont encore limitées. Pendant ce temps, la contamination microbienne et les propriétés polytropes des cellules d’invertébrés marins entravent davantage l’établissement d’une stratégie efficace de culture cellulaire pour les invertébrés marins. Ici, nous décrivons une méthode facile à manipuler pour cultiver les cellules intestinales du concombre de mer Apostichopus japonicus; en outre, nous fournissons un exemple d’induction et de détection in vitro d’apoptose dans les cellules intestinales cultivées primaires. En outre, cette expérience fournit des détails sur le milieu de culture approprié et la méthode de collecte cellulaire. Le protocole décrit est compatible avec une variété d’échantillons de tissus largement disponibles provenant d’organismes marins, y compris Echinodermata, Mollusca et Crustacea, et il peut fournir des cellules suffisantes pour de multiples applications expérimentales in vitro. Cette technique permettrait aux chercheurs de manipuler efficacement les cultures cellulaires primaires des invertébrés marins et de faciliter l’évaluation fonctionnelle des matériaux biologiques ciblés sur les cellules.
Introduction
La culture des cellules dans des conditions artificiellement contrôlées, et non dans leur environnement naturel, fournit des matériaux expérimentaux uniformes pour les études biologiques, en particulier pour les espèces qui ne peuvent pas être facilement cultivées dans un environnement de laboratoire. Les invertébrés marins représentent plus de 30% de toutes les espèces animales1, et ils fournissent de nombreux matériaux biologiques pour entreprendre des recherches sur les mécanismes de régulation de processus biologiques spécifiques, tels que la régénération2,3, la réponse au stress4, et l’adaptation environnementale5,6.
Le concombre de mer, Apostichopus japonicus, est l’une des espèces d’échinodermes les plus étudiées qui habitent les eaux tempérées le long de la côte du Pacifique Nord. Il est bien connu comme une espèce commercialement importante et maricultured sur une grande échelle en Asie de l’Est, en particulier en Chine7. De nombreuses questions scientifiques concernant A. japonicus, y compris les mécanismes de régulation sous-jacents à la régénération intestinale après l’éviscération8 et la dégénérescence dans l’estivation9, le contrôle métabolique10,11, et la réponse immunitaire12,13 sous des contraintes thermiques ou pathogènes, ont attiré l’attention des chercheurs. Cependant, par rapport aux animaux modèles bien étudiés, la recherche fondamentale, en particulier au niveau cellulaire, est limitée par des goulots d’étranglement techniques, tels que l’absence de méthodes avancées de culture cellulaire.
Les chercheurs ont consacré beaucoup d’efforts à l’établissement de lignées cellulaires, mais ils ont également fait face à de nombreux défis et aucune lignée cellulaire d’aucun invertébré marin n’a été établie encore14. Cependant, les cultures cellulaires primaires des invertébrés marins ont progressé au cours des dernières décennies15,16, et ils ont fourni une occasion d’expérimentation au niveau cellulaire. Par exemple, l’intesine régénératrice de A. japonicus a été utilisée comme source de cellules pour les cultures cellulaires à long terme qui ont fourni une méthode pratique pour la culture cellulaire primaire des invertébrés marins17. Ce protocole a combiné et optimisé les approches de culture cellulaire des invertébrés et a mis au point une méthode de culture primaire largement appropriée pour le concombre de mer ou d’autres invertébrés marins.
L’apoptose est un programme intrinsèque de suicide cellulaire déclenché par divers stimuli exogènes et endogènes. L’apoptose coordonnée est cruciale pour de nombreux systèmes biologiques18,19, et il a été impliqué dans la régression intestinale du concombre de mer lors de l’aestivation9. Pour étudier le processus apoptotique dans les organismes d’intérêt, une série de méthodes, y compris la coloration Hoechst et des essais de microscopie, ont été établis et appliqués avec succès20. Ici, nous avons effectué l’induction et la détection d’apoptose dans les cellules intestinales cultivées primaires du concombre de mer pour évaluer la facilité d’utilisation des cellules primaires dans les études biologiques des invertébrés marins. Dexamethasone, l’un des glucocorticostéroïdes synthétiques couramment utilisés21, a été utilisé pour induire l’apoptose dans les cellules intestinales cultivées de concombre de mer, et le signal significatif Hoechst 33258 a été détecté avec succès dans les cellules tachées par microscopie fluorescente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des efforts de recherche approfondis ont été consacrés à l’établissement de lignées cellulaires au cours des dernières décennies, cependant, il est encore difficile de faire des progrès sur la culture à long terme des cellules des invertébrés marins14,22. Il a été rapporté que les cellules cultivées des tissus holothuriens régénérants étaient viables pendant une longue période de temps et l’activité élevée de la prolifération peut être d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent remercier le professeur Naiming Zhou de l’Université du Zhejiang pour ses conseils techniques et pour avoir mis à la disposition de l’équipement de son laboratoire une utilisation. Ce travail a été soutenu financièrement par la National Natural Science Foundation of China (numéros de subvention 41876154, 41606150 et 41406137) et les Fonds de recherche fondamentale pour les universités provinciales et les instituts de recherche du Zhejiang [numéro de subvention 2019JZ00007 ].
Materials
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
References
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