Induzione e rilevamento dell'apoptosi in una cultura primaria delle cellule intestinali del cetriolo marino
Summary
Questo protocollo fornisce un metodo facile da gestire per la coltura delle cellule intestinali dal cetriolo di mare Apostichopus japonicus japonicus ed è compatibile con una varietà di campioni di tessuto ampiamente disponibili da organismi marini tra cui Echinodermata, Mollusca e Crustacea.
Abstract
Le cellule coltivate primarie sono utilizzate in una varietà di discipline scientifiche come strumenti eccezionalmente importanti per la valutazione funzionale di sostanze biologiche o la caratterizzazione di specifiche attività biologiche. Tuttavia, a causa della mancanza di mezzi e protocolli di coltura cellulare universalmente applicabili, i metodi di coltura cellulare ben descritti per gli organismi marini sono ancora limitati. Nel frattempo, la contaminazione microbica e le proprietà politropiche comunemente presenti delle cellule invertebrate marine ostacolano ulteriormente l’istituzione di una strategia di coltura cellulare efficace per gli invertebrati marini. Qui, descriviamo un metodo facile da gestire per la coltura di cellule intestinali dal cetriolo di mare Apostichopus japonicus; inoltre, forniamo un esempio di induzione e rilevamento di apoptosi in vitro nelle cellule intestinali coltivate primarie. Inoltre, questo esperimento fornisce dettagli sul metodo di raccolta delle cellule e del mezzo di coltura appropriato. Il protocollo descritto è compatibile con una varietà di campioni di tessuto ampiamente disponibili da organismi marini, tra cui Echinodermata, Mollusca e Crustacea, e può fornire cellule sufficienti per molteplici applicazioni sperimentali in vitro. Questa tecnica consentirebbe ai ricercatori di manipolare in modo efficiente le colture cellulari primarie dagli invertebrati marini e di facilitare la valutazione funzionale di materiali biologici mirati sulle cellule.
Introduction
Le cellule di coltura in condizioni controllate artificialmente, e non nel loro ambiente naturale, forniscono materiali sperimentali uniformi per studi biologici, in particolare per specie che non possono essere facilmente coltivate in un ambiente di laboratorio. Gli invertebrati marini rappresentano oltre il 30% di tutte le specie animali1e forniscono numerosi materiali biologici per intraprendere ricerche sui meccanismi normativi di processi biologici specifici, come la rigenerazione2,3, la risposta allo stress4e l’adattamento ambientale5,6.
Il cetriolo di mare, Apostichopus japonicus, è una delle specie di echinoderm più studiate che abitano acque temperate lungo la costa del Pacifico settentrionale. E ‘ben noto come una specie commercialmente importante e maricultured su larga scala in Asia orientale, soprattutto in Cina7. Numerose domande scientifiche riguardanti A. japonicus, tra cui i meccanismi regolatori alla base della rigenerazione intestinale dopo l’eviscerazione8 e la degenerazione in un’aestivazione9, controllo metabolico10,11, e risposta immunitaria12,13 sotto stress termico o patogeno, hanno attirato l’attenzione dei ricercatori. Tuttavia, rispetto agli animali modello ben studiati, la ricerca di base, soprattutto a livello cellulare, è limitata da colli di bottiglia tecnici, come la mancanza di metodi avanzati di coltura cellulare.
I ricercatori hanno dedicato molti sforzi per stabilire le linee cellulari, ma hanno anche affrontato molte sfide e nessuna linea cellulare da qualsiasi invertebrato marino è stata stabilita ancora14. Tuttavia, le colture cellulari primarie da invertebrati marini sono progredite negli ultimi decenni15,16, e hanno fornito un’opportunità per la sperimentazione a livello cellulare. Ad esempio, l’intesina rigenerante da A. japonicus è stata utilizzata come fonte di cellule per colture cellulari a lungo termine che ha fornito un metodo pratico per la coltura cellulare primaria degli invertebrati marini17. Questo protocollo combinava e ottimizzato gli approcci di coltura delle cellule invertebrate e sviluppava un metodo di coltura primaria ampiamente adatto per cetrioli di mare o altri invertebrati marini.
L’apoptosi è un programma di suicidio cellulare intrinseco innescato da vari stimoli esogeni ed endogeni. L’apoptosi coordinata è fondamentale per molti sistemi biologici18,19, ed è stata implicata nella regressione intestinale del cetriolo di mare durante l’acentratura9. Per studiare il processo apoptotico negli organismi di interesse, sono stati stabiliti e applicati con successo20metodi, tra cui la colorazione di Hoechst e i saggi di microscopia. Qui, abbiamo condotto l’induzione e il rilevamento dell’apoptosi nelle cellule intestinali coltivate primarie del cetriolo marino per valutare l’usabilità delle cellule primarie negli studi biologici degli invertebrati marini. Dexamethasone, uno dei glucocorticosteroidi sintetici comunemente usati21, è stato utilizzato per indurre l’apoptosi nelle cellule intestinali coltivate dal cetriolo marino, e significativo segnale Hoechst 33258 è stato rilevato con successo nelle cellule colorate dalla microscopia fluorescente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Negli ultimi decenni sono stati dedicati ampi sforzi di ricerca per stabilire le linee cellulari, tuttavia, è ancora difficile fare un progresso sulla coltura a lungo termine delle cellule da invertebrati marini14,22. È stato riferito che le cellule coltivate provenienti da tessuti olothuriani rigeneranti erano vitali per un lungo periodo di tempo e un’elevata attività di proliferazione può essere rilevata in cellule specifiche17,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il prof. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (numeri di sovvenzione 41876154, 41606150 e 41406137) e dai Fondi di ricerca fondamentali per le università e gli istituti di ricerca provinciali di ].
Materials
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
References
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