Apoptose induktion og detektion i en primær kultur af Havagurk Tarmceller
Summary
Denne protokol giver en nem at håndtere metode til kultur tarmcellerne fra havet agurk Apostichopus japonicus og er kompatibel med en række bredt tilgængelige vævsprøver fra marine organismer, herunder ECHINODERMATA, Mollusca, og krebsdyr.
Abstract
Primær dyrkede celler anvendes i en række videnskabelige discipliner som usædvanligt vigtige værktøjer til funktionel evaluering af biologiske stoffer eller karakterisering af specifikke biologiske aktiviteter. Men på grund af manglen på universelt anvendelig cellekultur medier og protokoller, velbeskrevne cellekultur metoder til marine organismer er stadig begrænset. I mellemtiden hindrer den almindeligt forekommende mikrobielle kontaminering og polytrope egenskaber af marine hvirvelløse celler yderligere etableringen af en effektiv cellekultur strategi for hvirvelløse havdyr. Her beskriver vi en nem at håndtere metode til dyrkning af tarmceller fra havagurk Apostichopus japonicus; Derudover giver vi et eksempel på in vitro apoptose induktion og detektion i primære dyrkede tarmceller. Desuden giver dette eksperiment oplysninger om den relevante dyrkningsmedium og celle indsamlingsmetode. Den beskrevne protokol er kompatibel med en række bredt tilgængelige vævsprøver fra marine organismer, herunder ECHINODERMATA, Mollusca, og krebsdyr, og det kan give tilstrækkelige celler til flere in vitro eksperimentelle applikationer. Denne teknik vil gøre det muligt for forskerne effektivt at manipulere primær cellekulturer fra hvirvelløse havdyr og at lette den funktionelle evaluering af målrettede biologiske materialer på celler.
Introduction
Dyrkning af celler under kunstigt kontrollerede forhold, og ikke i deres naturlige miljø, giver ensartede eksperimentelle materialer til biologiske undersøgelser, især for arter, der ikke let kan dyrkes i et laboratoriemiljø. Marine hvirvelløse dyr tegner sig for mere end 30% af alle dyrearter1, og de leverer talrige biologiske materialer til forskning i reguleringsmekanismerne for specifikke biologiske processer, såsom regenerering2,3, stress respons4, og miljøtilpasning5,6.
Havet agurk, Apostichopus japonicus, er en af de mest studerede echinoderm arter, der lever tempererede farvande langs den nordlige Stillehav kyst. Det er velkendt som en kommercielt vigtig art og havdet i stor skala i Østasien, især i Kina7. Talrige videnskabelige spørgsmål vedrørende A. japonicus, herunder de regulerende mekanismer underliggende tarm regenerering efter udtagning8 og degeneration i aestivation9, metaboliske kontrol10,11, og immunrespons12,13 under termiske eller patogene belastninger, har tiltrukket sig opmærksomhed fra forskere. Men sammenlignet med velstuderet model dyr, grundforskning, især på cellulært niveau, er begrænset af tekniske flaskehalse, såsom manglen på avancerede cellekultur metoder.
Forskerne har viet en stor indsats for at etablere cellelinjer, men de har også stået over for mange udfordringer, og ingen cellelinje fra nogen Marine hvirvelløse er blevet etableret endnu14. Imidlertid har primære cellekulturer fra hvirvelløse havdyr fremskreden i de sidste årtier15,16, og de har givet mulighed for eksperimenter på cellulært niveau. For eksempel er den regenererende intesine fra A. japonicus blevet udnyttet som en kilde til celler for langsigtede cellekulturer, som leverede en praktisk metode til primær cellekultur af marine hvirvelløse dyr17. Denne protokol kombineret og optimeret hvirvelløse cellekultur tilgange og udviklet en bredt egnet primær kultur metode til havagurk eller andre marine hvirvelløse dyr.
Apoptose er en iboende celle selvmord program udløst af forskellige eksogene og endogene stimuli. Koordineret apoptose er afgørende for mange biologiske systemer18,19, og det har været impliceret i tarm regression af havagurk under aestivation9. For at undersøge den apoptotiske proces i interesse organismer er der blevet etableret en række metoder, herunder Hoechst-farvning og mikroskopi analyser, og20er blevet anvendt med succes. Her udførte vi apoptose induktion og detektion i primære dyrkede tarmceller af havagurk for at vurdere anvendeligheden af primære celler i biologiske undersøgelser af hvirvelløse havdyr. Dexamethason, en af de almindeligt anvendte syntetiske glukokortikosteroider21, blev brugt til at inducere apoptose i dyrkede tarmceller fra havagurk, og betydelige Hoechst 33258 signal blev med succes påvist i de farvede celler ved fluorescerende mikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Omfattende forskningsindsats har været afsat til at etablere cellelinjer i de sidste årtier, men det er stadig vanskeligt at gøre en fremskridt på lang sigt kultur af celler fra marine hvirvelløse dyr14,22. Det er blevet rapporteret, at dyrkede celler fra regenererende holothurian væv var levedygtige i en lang periode, og høj aktivitet af spredning kan påvises i specifikke celler17,23. Men for de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Prof. Naiming Zhou fra Zhejiang University for hans tekniske rådgivning og for at gøre udstyret i hans laboratorium til rådighed til brug. Dette arbejde blev finansielt støttet af Kinas National Natural Science Foundation (tilskudsnummer 41876154, 41606150 og 41406137) og de grundlæggende forskningsfonde for Zhejiang Provincial universiteter og forskningsinstitutter [Grant Number 2019JZ00007 ].
Materials
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
References
- Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).
- Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers. Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).
- Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis. Bmc Genomics. 17, 718 (2016).
- Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816). Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).
- Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas). Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).
- Han, G., Zhang, S., Dong, Y. Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction. Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).
- Zhang, X., et al. The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration. PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).
- Sun, L., et al. iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).
- Xu, K., et al. Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).
- Yang, H. S., et al. Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).
- Xiang, X. W., et al. Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses. Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).
- Jiang, L., et al. A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus. International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).
- Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database. Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).
- Cai, X., Zhang, Y. Marine invertebrate cell culture: a decade of development. Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).
- Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons. Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).
- Pinsino, A., Alijagic, A. Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions. Biology Open. 8 (3), (2019).
- Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures. Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).
- Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity. Excli Journal. 8, 155-181 (2009).
- Wan, L., et al. Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits. Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).
- Kasibhatla, S., et al. Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).
- Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes. Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).
- Rinkevich, B. Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness. Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).
- Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues. Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).
- Yu, H., et al. Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka). Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).
