Optimisation des processus à l’aide de micro-bioréacteurs automatisés à haut débit dans la culture chinoise de cellules d’ovaires de Hamster
Summary
Ici, nous présentons une procédure détaillée pour exécuter une conception de l’expérience dans un micro-bioréacteur automatisé suivi par la récolte cellulaire et la quantification des protéines à l’aide d’une colonne de protéines A.
Abstract
L’optimisation des bioprocessus pour augmenter le rendement des produits désirés est importante dans l’industrie biopharmaceutique. Ceci peut être réalisé par la sélection des souches et par le développement de paramètres de bioprocessus. Des flacons de secousse ont été utilisés à cette fin. Ils n’ont toutefois pas la capacité de contrôler les paramètres du processus tels que le pH et l’oxygène dissous (DO). Cette limitation peut être surmontée à l’aide d’un micro-bioréacteur automatisé. Ces bioréacteurs imitent la culture à plus grande échelle. L’un des principaux avantages de ce système est l’intégration de la conception de l’expérience (DOE) dans le logiciel. Cette intégration permet d’établir une conception où plusieurs paramètres de processus peuvent être variés simultanément. Les paramètres critiques du processus et les conditions optimales de bioprocessus peuvent être analysés dans le logiciel. L’objectif du travail présenté ici est d’introduire l’utilisateur aux étapes impliquées dans la conception de processus dans le logiciel et l’incorporation du DOE dans la culture.
Introduction
Le marché biopharmaceutique mondial valait plus de 250 milliards de dollars AMÉRICAINS en 2018 et n’a cessé d’augmenterde 1. Les sociétés pharmaceutiques s’éloignent de la production de petits médicaments moléculaires à des thérapies biotechno logiquement produites telles que des protéines recombinantes. À eux seuls, ils représentent un chiffre d’affaires de plus de 150 milliards de dollars1. Les cellules mammifères sont maintenant largement utilisées pour la production de ces protéines recombinantes pharmaceutiques. Dans la période actuelle, parmi les 68 produits approuvés produits par des cellules de mammifères, 57 sont produits par les cellules ovaires hamster chinois (CHO)2. Les cellules CHO sont spécifiquement utilisées pour la production de protéines recombinantes qui nécessitent des modifications post-traductionnelles. Ces cellules sont préférées car elles se développent dans une suspension et permettent ainsi des résultats reproductibles dans un milieu chimiquement défini de sérum3,4. L’autre avantage de l’utilisation des cellules DE CHO est que la structure de glycan du produit ressemble à celle de l’anticorps monoclonal humain (mAb) et a comme conséquence le rendement plus élevé de protéine recombinante et la productivité spécifique due à l’amplification de gène5.
Le rendement de la culture cellulaire recombinante CHO (rCHO) a été multiplié par cent au cours des deux dernières décennies. Cette amélioration est attribuée à l’optimisation des paramètres du processus, à la stratégie d’alimentation et au développement du milieu6défini chimiquement par le sérum. Avec l’augmentation des besoins des produits pharmaceutiques, la pression augmente sur l’efficacité des coûts et du temps pour le développement du processus de production7. Pour réduire la pression tout en assurant la qualité du produit a redirigé l’accent de l’industrie pharmaceutique sur la qualité par la conception (QbD). QbD est utilisé pour comprendre la production du produit ainsi que le processus. Un outil essentiel utilisé dans l’ObD est la conception de l’expérience (DOE). Il contribue à mieux comprendre le processus en révélant la relation entre les différentes variables d’entrée et les données de sortie qui en résultent. L’application de l’approche DOE pour optimiser le bioprocessus est bénéfique au cours des premières étapes du projet dans l’assimiler les conditions du processus et d’augmenter la quantité et la qualité de titer. Cette approche est bénéfique par rapport à la stratégie à l’ancienne : un facteur à la fois (OFAT). Les approches statistiques du DOE à l’aide de Classical, Shainin ou Taguchi sont de loin supérieures à l’OFAT8.
Le processus et l’optimisation des médias peuvent être effectués dans des flacons de secousse. Les flacons sont relativement peu coûteux. Cependant, il n’est pas possible de contrôler des paramètres tels que la température, le pH et l’oxygène dissous (DO). Pour surmonter ces inconvénients, des bioréacteurs multi-utilisés de banc-top allant du volume de travail de 0,5 L à 5 L peuvent être utilisés. Les réacteurs assurent une surveillance et un contrôle complets des procédés en ligne. Cependant, l’utilisation du bioréacteur multi-utilisation est exigeante en temps et en main-d’œuvre. Afin de surmonter ces inconvénients, un nouveau bioréacteur à usage unique qui combine le processus complet de surveillance du bioréacteur de banc-dessus et la manipulation facile du flacon de secousse est utilisé. Le système de criblage à haut débit et la technologie à usage unique ont contribué à améliorer l’efficacité de la performance et du développement des processus9.
Dans cet article, les lignes directrices pour charger la recette dans le logiciel automatisé de micro-bioréacteur (AMBR) sont énumérées. L’influence de différentes vitesses d’agitateur et de pH sur la concentration de cellules viables (VCC) et le titer est étudiée au cours de cette expérience. Le résultat expérimental et l’analyse sont effectués avec la conception du logiciel d’expérience MODDE 12. L’analyse du produit est effectuée dans un système de chromatographie liquide à haute pression (HPLC) avec une colonne Protéique A. Il est basé sur le principe que la région de Fc du mAb se lie à la protéine A avec une affinité élevée10,11. Avec cette méthode, il est possible d’identifier et de quantifier le mAb. La quantification est effectuée sur les zones mesurées de pointe d’elution à 280 nm.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’optimisation du processus d’augmentation du rendement est d’une importance cruciale dans l’industrie biopharmaceutique. Des flacons de secousse pourraient être utilisés pour le criblage de la souche; cependant, la surveillance des paramètres du processus tels que le pH et le DO ne sont pas disponibles dans les flacons. Les micro-bioréacteurs ont un avantage car ils permettent une surveillance et un contrôle continus du processus. Ces boucles de contrôle dans le micro-bioréacteur fournissent également un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent remercier le Bundesministerium f’r Bildung und Forschung (BMBF), le Ministère fédéral de l’éducation et de la recherche, en Allemagne, et l’équipe bioprocessue de Sartorius Stedim Biotech GmbH, en Allemagne, pour leur soutien.
Materials
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Antifoam C Emulsion | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| Bottle Top Sterile filter | Corning, Merck | CLS431474 | 0.1 μm pore size |
| CEDEX Detergent (3% Mucosol) | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| Cell counter | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 cell line | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO Feed Media A (FMA) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO Feed Media B (FMB) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO Production Medium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO Stock Culture Meium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Chromaster high pressure liquid chromatography system | VWR International | ||
| Conical Centrifuge tube | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| Ethanol | Merck | 1070179026 | |
| Glycine | Carl Roth | 56-40-6 | |
| HPLC Vials | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich,Merck | P4417 | |
| Protein A Column | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1.7 mL |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| Trypan Blue | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Select |
References
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nature Biotechnology. 36, 1136 (2018).
- Kim, J. Y., Kim, Y., Lee, G. M. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 917-930 (2012).
- Lai, T., Yang, Y., Ng, S. K. Advances in Mammalian cell line development technologies for recombinant protein production. Pharmaceuticals (Basel). 6 (5), 579-603 (2013).
- Carlage, T., et al. Analysis of dynamic changes in the proteome of a Bcl-XL overexpressing Chinese hamster ovary cell culture during exponential and stationary phases. Biotechnology Progress. 28 (3), 814-823 (2012).
- Hacker, D. L., de Jesus, M., Wurm, F. M. 25 years of recombinant proteins from reactor-grown cells – where do we go from here. Biotechnology Advances. 27 (6), 1023-1027 (2009).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends in Biotechnology. 31 (3), 147-154 (2013).
- Ao, S., Gelman, L. . Advances in electrical engineering and computational science. Lecture notes in electrical engineering. 39, (2009).
- Bareither, R., et al. Automated disposable small scale reactor for high throughput bioprocess development: a proof of concept study. Biotechnology and Bioengineering. 110 (12), 3126-3138 (2013).
- Kang, Y., Ludwig, D. L., Balderes, P. What can cell culture flocculation offer for antibody purification processes. Pharmaceutical Bioprocessing. 2 (6), 483-485 (2014).
- Choe, W., Durgannavar, T. A., Chung, S. J. Fc-Binding Ligands of Immunoglobulin G: An Overview of High Affinity Proteins and Peptides. Materials (Basel). 9 (12), (2016).
- Schäpper, D., et al. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Zhang, Z., et al. Microbioreactors for Bioprocess Development. Journal of the Association for Laboratory Automation. 12 (3), 143-151 (2007).
- Claßen, J., et al. Spectroscopic sensors for in-line bioprocess monitoring in research and pharmaceutical industrial application. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (3), 651-666 (2017).
- Janoschek, S., et al. A protocol to transfer a fed-batch platform process into semi-perfusion mode: The benefit of automated small-scale bioreactors compared to shake flasks as scale-down model. Biotechnology Progress. 35 (2), 2757 (2019).
