Otimização de processos usando micro-bioreatores automatizados de alto throughput no cultivo de células de ovário de hamster chinês
Summary
Aqui, apresentamos um procedimento detalhado para executar um Projeto de Experimento em um micro-bioreator automatizado seguido de colheita celular e quantificação de proteínas usando uma coluna de Proteína A.
Abstract
A otimização de bioprocessos para aumentar o rendimento dos produtos desejados é de importância na indústria biofarmacêutica. Isso pode ser alcançado através da seleção de cepas e do desenvolvimento de parâmetros de bioprocesso. Frascos de agitação foram usados para este fim. Eles, no entanto, não têm a capacidade de controlar os parâmetros do processo, como pH e oxigênio dissolvido (DO). Essa limitação pode ser superada com a ajuda de um micro-bioreator automatizado. Estes bioreatores imitam o cultivo em uma escala maior. Uma das principais vantagens deste sistema é a integração do Design of Experiment (DOE) no software. Essa integração permite estabelecer um projeto onde vários parâmetros de processo podem ser variados simultaneamente. Os parâmetros críticos do processo e as condições ideais de bioprocesso podem ser analisados dentro do software. O foco do trabalho aqui apresentado é introduzir o usuário às etapas envolvidas na concepção do processo no software e incorporação do DOE dentro da corrida de cultivo.
Introduction
O mercado biofarmacêutico global valia mais de US$ 250 bilhões em 2018 e vem continuamente expandindo1. As empresas farmacêuticas estão se afastando da produção de pequenos fármacos moleculares para terapêuticas biotecnológicas, como proteínas recombinantes. Só estes são responsáveis por uma receita de mais de US $ 150 bilhões1. As células dos mamíferos são agora amplamente utilizadas para a produção dessas proteínas farmacêuticas recombinantes. No período atual, dos 68 produtos aprovados produzidos por células de mamíferos, 57 são produzidos por células chinesas de ovário hamster (CHO)2. As células CHO são especificamente utilizadas para a produção de proteínas recombinantes que requerem modificações pós-translacionais. Estas células são preferidas à medida que crescem em uma suspensão e, assim, permitem resultados reprodutíveis em um meio quimicamente definido quimicamentelivre 3,4. A outra vantagem do uso de células CHO é que a estrutura glicana do produto se assemelha à do anticorpo monoclonal humano (mAb) e resulta em maior rendimento de proteína recombinante e produtividade específica devido à amplificação genética5.
O rendimento da cultura celular recombinante CHO (rCHO) aumentou cem vezes nas últimas duas décadas. Essa melhora é atribuída à otimização dos parâmetros do processo, à estratégia de alimentação e ao desenvolvimento do meio quimicamente definido quimicamente6. Com o aumento das exigências dos produtos farmacêuticos, a pressão aumenta sobre o custo e a eficiência de tempo para o desenvolvimento do processo produtivo7. Reduzir a pressão e, ao mesmo tempo, garantir a qualidade do produto redirecionou o foco da indústria farmacêutica em Qualidade por Design (QbD). O QbD é usado para entender a produção do produto, bem como o processo. Uma ferramenta vital usada no ObD é o Design of Experiment (DOE). Ele ajuda a aumentar a compreensão do processo, revelando a relação entre várias variáveis de entrada e dados de saída resultantes. A aplicação da abordagem do DOE para otimizar o bioprocesso é benéfica durante os estágios iniciais do projeto na assimilação das condições do processo e aumento da quantidade e qualidade do título. Essa abordagem é benéfica quando comparada com a estratégia antiquada: um fator de cada vez (OFAT). As abordagens estatísticas do DOE usando Classic, Shainin ou Taguchi são muito superiores ao OFAT8.
O processo e a otimização da mídia podem ser realizados em frascos de shake. Os frascos são relativamente baratos. No entanto, não é possível controlar parâmetros como temperatura, pH e oxigênio dissolvido (DO). Para superar essas desvantagens, podem ser utilizados bioreatores multiuso de bancada que variam de volume de trabalho de 0,5 L a 5 L. Os reatores fornecem um extenso monitoramento on-line e controle de processos. No entanto, o uso do bioreator multiuso é de tempo e trabalho intensivo. Para superar essas desvantagens, um novo bioreator de uso único que combina o processo abrangente de monitoramento do bioreator de bancada e fácil manuseio do frasco de shake é usado. O sistema de triagem de alto rendimento e a tecnologia de uso único contribuíram para aumentar a eficiência do desempenho e desenvolvimento do processo9.
Neste artigo, estão listadas as diretrizes para carregar a receita no software automatizado de micro-bioreator (AMBR). A influência de diferentes velocidades de agitador e pH na concentração celular viável (VCC) e título é estudada durante este experimento. O resultado experimental e a análise são realizados com o projeto do software de experimento MODDE 12. A análise do produto é realizada em um sistema de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) com uma coluna de proteína A. Baseia-se no princípio de que a região Fc do mAb se liga à proteína A com alta afinidade10,11. Com este método, é possível identificar e quantificar o mAb. A quantificação é realizada sobre as áreas de pico de elução medidos em 280 nm.
Protocol
Representative Results
Discussion
A otimização do processo para aumentar o rendimento é de fundamental importância na indústria biofarmacêutica. Frascos de agitação poderiam potencialmente ser usados para a triagem da cepa; no entanto, o monitoramento dos parâmetros do processo, como pH e DO, não está disponível nos frascos. Os micro-bioreatores têm uma vantagem, pois permitem o monitoramento contínuo e o controle do processo. Esses laços de controle no micro-bioreator também fornecem uma condição semelhante àquelas em maior escala e, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), ao Ministério Federal de Educação e Pesquisa, alemanha, e à equipe de BioProcessamento da Sartorius Stedim Biotech GmbH, Alemanha, pelo apoio.
Materials
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Antifoam C Emulsion | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| Bottle Top Sterile filter | Corning, Merck | CLS431474 | 0.1 μm pore size |
| CEDEX Detergent (3% Mucosol) | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| Cell counter | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 cell line | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO Feed Media A (FMA) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO Feed Media B (FMB) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO Production Medium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO Stock Culture Meium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Chromaster high pressure liquid chromatography system | VWR International | ||
| Conical Centrifuge tube | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| Ethanol | Merck | 1070179026 | |
| Glycine | Carl Roth | 56-40-6 | |
| HPLC Vials | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich,Merck | P4417 | |
| Protein A Column | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1.7 mL |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| Trypan Blue | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Select |
References
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