Processoptimering med hög genomströmning Automatiserad Mikro-Bioreaktorer i kinesisk hamster äggstockscellodling
Summary
Här presenterar vi ett detaljerat förfarande för att köra en design av experiment i en automatiserad mikro-bioreaktor följt av cellskörd och proteinkvantifiering med hjälp av en Protein A-kolumn.
Abstract
Optimering av bioprocesser för att öka avkastningen av önskade produkter är av betydelse inom den biofarmaceutiska industrin. Detta kan uppnås genom stamval och genom att utveckla bioprocessparametrar. Shake kolvar har använts för detta ändamål. De saknar dock förmågan att kontrollera processparametrar som pH och upplöst syre (DO). Denna begränsning kan övervinnas med hjälp av en automatiserad mikrobioreaktor. Dessa bioreaktorer efterliknar odling i större skala. En av de stora fördelarna med detta system är integrationen av Design of Experiment (DOE) i programvaran. Den här integreringen gör det möjligt att upprätta en design där flera processparametrar kan varieras samtidigt. De kritiska processparametrarna och optimala bioprocessförhållanden kan analyseras inom programvaran. Fokus för det arbete som presenteras här är att introducera användaren till de steg som ingår i processdesign i programvaran och införlivandet av DOE inom odlingskörningen.
Introduction
Den globala biofarmaceutiska marknaden var värd mer än 250 miljarder DOLLAR under 2018 och har kontinuerligt expanderat1. Läkemedelsföretag är på väg bort från att producera små molekylära läkemedel till biotekniskt producerade therapeutics såsom rekombinanta proteiner. Dessa ensam är ansvariga för en omsättning på mer än $ 150 miljarder1. Däggdjursceller används nu i stor utsträckning för produktion av dessa farmaceutiska rekombinanta proteiner. Under innevarande period, bland de 68 godkända produkter som produceras av däggdjursceller, produceras 57 av kinesiska hamsteräggstockar (CHO)2. CHO-celler används specifikt för produktion av rekombinanta proteiner som kräver post-translationella modifieringar. Dessa celler är att föredra när de växer i en suspension och därmed möjliggöra reproducerbara resultat i ett serum fritt kemiskt definierat medium3,4. Den andra fördelen med att använda CHO-celler är att produktens glykanstruktur liknar den mänskliga monoklonala antikroppen (mAb) och resulterar i högre rekombinant proteinavkastning och specifik produktivitet på grund av genförstärkning5.
Avkastningen av rekombinant CHO (rCHO) cellkultur har ökat med hundra gånger under de senaste två decennierna. Denna förbättring tillskrivs optimering av processparametrar, utfodring strategi och utveckling av serum fritt kemiskt definierade medium6. Med de ökade kraven på läkemedelsprodukterna ökar trycket på kostnads- och tidseffektiviteten för utvecklingen av produktionsprocessen7. För att minska trycket samtidigt säkerställa produktkvalitet har omdirigerat fokus för läkemedelsindustrin på Kvalitet by Design (QbD). QbD används för att förstå såväl produktproduktionen som processen. Ett viktigt verktyg som används i ObD är Design of Experiment (DOE). Det bidrar till att öka förståelsen för processen genom att avslöja förhållandet mellan olika indatavariabler och resulterande utdata. Att tillämpa DOE-metoden för att optimera bioprocess är fördelaktigt under de tidiga stadierna av projektet när det gäller att tillgodogöra sig processförhållandena och öka titerkvantiteten och kvaliteten. Detta tillvägagångssätt är fördelaktigt jämfört med den gammaldags strategin: en faktor-i-taget (OFAT). De statistiska metoderna för att göra med klassisk, Shainin eller Taguchi är vida överlägsen OFAT8.
Processen och medieoptimering kan utföras i skaka flaskor. Kolvarna är relativt billiga. Det är dock inte möjligt att kontrollera parametrar som temperatur, pH och upplöst syre (DO). För att övervinna dessa nackdelar kan multiuse bänk-top bioreaktorer från arbetsvolym på 0,5 L till 5 L användas. Reaktorerna ger en omfattande on-line övervakning och processkontroll. Användningen av multiusende bioreaktorn är dock tids- och arbetsintensiv. För att komma till rätta med dessa nackdelar används en ny bioreaktor för engångsbruk som kombinerar den omfattande processen att övervaka bioreaktorn med bänkskiva och enkel hantering av skakkolven. Screeningsystemet för hög genomströmning och teknik för engångsbruk har bidragit till att effektivisera processprestanda och utveckling9.
I den här artikeln listas riktlinjerna för att läsa in receptet i den automatiserade programvaran micro-bioreactor (AMBR). Påverkan av olika omrörningshastigheter och pH på den livsdugliga cellkoncentrationen (VCC) och titer studeras under detta experiment. Det experimentella resultatet och analysen utförs med design av experimentprogramvara MODDE 12. Produktanalysen utförs i ett HPLC-system (High Pressure Liquid Chromatography) med en Protein A-kolonn. Den bygger på principen att Fc-regionen i mAb binder till protein A med hög affinitet10,11. Med denna metod är det möjligt att identifiera och kvantifiera mAb. Kvantifieringen utförs över de uppmätta eluionstoppområdena på 280 nm.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optimering av processen för att öka avkastningen är av avgörande betydelse i den biofarmaceutiska industrin. Skakkolvar skulle kunna användas för att avskärma stammen. Övervakningen av processparametrarna, såsom pH och DO, är dock inte tillgänglig i kolvarna. Mikrobioreaktorerna har en fördel eftersom de möjliggör kontinuerlig övervakning och kontroll av processen. Dessa kontrollslingor i mikrobioreaktorn ger också ett tillstånd som liknar dem i större skala och därmed ger resultat som är jämförbara…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), det federala ministeriet för utbildning och forskning, Tyskland, och BioProcessing team av Sartorius Stedim Biotech GmbH, Tyskland, för deras stöd.
Materials
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Antifoam C Emulsion | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| Bottle Top Sterile filter | Corning, Merck | CLS431474 | 0.1 μm pore size |
| CEDEX Detergent (3% Mucosol) | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| Cell counter | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 cell line | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO Feed Media A (FMA) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO Feed Media B (FMB) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO Production Medium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO Stock Culture Meium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Chromaster high pressure liquid chromatography system | VWR International | ||
| Conical Centrifuge tube | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| Ethanol | Merck | 1070179026 | |
| Glycine | Carl Roth | 56-40-6 | |
| HPLC Vials | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich,Merck | P4417 | |
| Protein A Column | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1.7 mL |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| Trypan Blue | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Select |
References
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nature Biotechnology. 36, 1136 (2018).
- Kim, J. Y., Kim, Y., Lee, G. M. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 917-930 (2012).
- Lai, T., Yang, Y., Ng, S. K. Advances in Mammalian cell line development technologies for recombinant protein production. Pharmaceuticals (Basel). 6 (5), 579-603 (2013).
- Carlage, T., et al. Analysis of dynamic changes in the proteome of a Bcl-XL overexpressing Chinese hamster ovary cell culture during exponential and stationary phases. Biotechnology Progress. 28 (3), 814-823 (2012).
- Hacker, D. L., de Jesus, M., Wurm, F. M. 25 years of recombinant proteins from reactor-grown cells – where do we go from here. Biotechnology Advances. 27 (6), 1023-1027 (2009).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends in Biotechnology. 31 (3), 147-154 (2013).
- Ao, S., Gelman, L. . Advances in electrical engineering and computational science. Lecture notes in electrical engineering. 39, (2009).
- Bareither, R., et al. Automated disposable small scale reactor for high throughput bioprocess development: a proof of concept study. Biotechnology and Bioengineering. 110 (12), 3126-3138 (2013).
- Kang, Y., Ludwig, D. L., Balderes, P. What can cell culture flocculation offer for antibody purification processes. Pharmaceutical Bioprocessing. 2 (6), 483-485 (2014).
- Choe, W., Durgannavar, T. A., Chung, S. J. Fc-Binding Ligands of Immunoglobulin G: An Overview of High Affinity Proteins and Peptides. Materials (Basel). 9 (12), (2016).
- Schäpper, D., et al. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Zhang, Z., et al. Microbioreactors for Bioprocess Development. Journal of the Association for Laboratory Automation. 12 (3), 143-151 (2007).
- Claßen, J., et al. Spectroscopic sensors for in-line bioprocess monitoring in research and pharmaceutical industrial application. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (3), 651-666 (2017).
- Janoschek, S., et al. A protocol to transfer a fed-batch platform process into semi-perfusion mode: The benefit of automated small-scale bioreactors compared to shake flasks as scale-down model. Biotechnology Progress. 35 (2), 2757 (2019).
